重庆万州疑似柑桔轮斑病的病原鉴定及防治药剂筛选

占 爽，吴 望，胡军华,2，吴玉珠，乔兴华，陈 力，程 兰，周 彦,2

(1 西南大学柑桔研究所，重庆，400712；2 农业部西南地区果树科学观测实验站，重庆，400712；3 重庆市万州区植物保护与果树技术推广站，重庆，404020)

2018年秋季至2019年春季，重庆市万州区的尤力克柠檬种植区域，突发大面积柑桔植株枝梢枯死、大量叶片枯萎伴随大量落果的现象，并且在邻近的脐橙和杂柑上也有类似现象发生。按照柑桔炭疽病采取相应的防控措施未能有效控制病害。从发病季节及主要症状来看，高度疑似由Pseudofabraeacitricarpa引起的柑桔真菌病害——柑桔轮斑病(the citrus target spot)[1-5]。在防治上，有研究者根据室内毒力测定，提出苯醚甲环唑、咪鲜胺对柑桔轮斑病病原菌有抑制作用[2]，但生产中可用于防控此病害的药剂有限[3]。目前，关于柑桔轮斑病病原菌的侵染机制、致病机理及系统防控方案等尚无报道。为了明确重庆市万州区疑似柑桔轮斑病的病原和初步筛选防控药剂，以重庆万州地区患病柑桔为材料，进行病原菌分离鉴定和致病性测定，同时进行常用杀菌剂室内毒力测试。

1 材料与方法

1.1 材料病害样品：采自重庆市万州区患病尤力克柠檬、北京柠檬和纽荷尔脐橙植株。

供试菌株：WZ1、WZ2和WZ3菌株分离自尤力克柠檬病害样品，NHRQC1菌株分离自纽荷尔脐橙病害样品，BJNM1菌株分离自北京柠檬病害样品。在PDA培养基上，20 ℃恒温培养10 d，4 ℃保存、备用。

供试组织材料：尤力克柠檬、红桔、北京柠檬、塔罗科血橙、W·默科特桔橙、大雅柑、纽荷尔脐橙、北碚447锦橙均采摘自国家果树种质重庆柑桔圃(重庆市北碚区歇马街道中国农业科学院柑桔研究所内)。昭通苹果(红富士品种)和砀山酥梨果实均购买于重庆市北碚区歇马街道超市。

1.2 致病菌鉴定观察患病柑桔样品，记录其特征。采用组织块分离法对样品进行病菌分离。菌株纯化后，挑取少量菌丝，加入30 μL 2× T5 Direct PCR Kit(Plant)(北京擎科新业生物技术有限公司)裂解液 Lysis Buffer A，95 ℃加热20 min。常规引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)/ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)扩增ITS片段。25 μL PCR 反应体系：T5 Plant 12 μL，模板1 μL，ITS1/ITS4各1 μL，ddH2O 10 μL。ITS扩增反应程序为：98 ℃预变性2 min，98 ℃变性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，35个循环；72 ℃补充延伸3 min。PCR扩增产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，送擎科公司测序。将测序结果序列提交至NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)数据库中进行比对分析，用MEGA-X邻接法(Neighbor-Joining)进行聚类分析，构建系统进化树(1 000次重复)。

1.3 致病性测定取尤力克柠檬秋季展开而未转绿叶片、未转褐枝条和膨大期果实，用75%酒精消毒20 s，无菌水冲洗3次，备用。叶片设置正面及反面的无伤接种、针刺2针接种和针刺10针接种，共6种处理方式；枝条设置无伤接种、刻伤接种和去皮接种3种处理方式；果实设置无伤接种、针刺10针接种和去皮接种3种处理方式。各处理接种WZ1菌株，对照组接种无菌PDA培养基。接种后，20 ℃保湿培养，每日观察发病情况，十字交叉法测量病斑直径并记录。

取其他柑桔品种的材料清洗完后，秋季展开未转绿叶片采用正面针刺10针接种，未转褐枝条采用去皮接种，膨大期果实采用针刺10针接种；昭通苹果和砀山酥梨果实采用针刺10针接种处理。20个样品一组，设置3次重复。各处理接种WZ1菌株，对照组接种PDA培养基。20 ℃保湿培养。十字交叉法测量病斑直径并记录。采用SPSS Statistics 25 软件分析数据。

1.4 常用杀菌剂室内药剂筛选供试杀菌剂包括：37%苯醚甲环唑WP(山东省绿士农药有限公司)、450 g/L咪鲜胺EC(安道麦马克西姆有限公司)、50%甲基硫菌灵SC(陕西汤普森生物科技有限公司)、3%噻霉酮ME(江苏辉丰农化股份有限公司)、50%醚菌酯WP(利尔化学股份有限公司)、40%腈菌唑WP(美国陶氏益农有限公司)、60%唑醚·代森联WP(巴斯夫欧洲公司)、30%碱式硫酸铜SC(保定农药厂)、25%嘧菌酯SC(英国先正达有限公司)、11.5%吡唑嘧菌脂EC(石家庄市深泰化工有限公司)、50%啶酰菌胺WG(巴斯夫欧洲公司)、86.2%氧化亚铜WP(挪威劳顿克斯公司)、12.5%烯唑醇WP(江苏托球农化股份有限公司)、99%噁霉灵DP(烟台鑫润精细化工有限公司)、250 g/L戊唑醇EW[安道麦(北京)农业技术有限公司]、75%肟菌·戊唑醇WG(德国拜耳作物科学公司)、46%氢氧化铜WP(上海生农生化制品股份有限公司)、60%霜脲·醚菌酯WP(美国世科姆公司)、70%丙森锌WP(德国拜耳作物科学公司)、80%克菌丹WP[安道麦(北京)农业技术有限公司]、80%代森锰锌WP(利民化工股份有限公司)、65%代森锌WP(深圳诺普信农化股份有限公司)、99%矿物油EC(天津绿颖农药销售有限公司)。

采用菌丝生长速率法进行杀菌剂毒力测定[6]。将各杀菌剂配置成1 mg/mL的母液，再将母液稀释成各浓度梯度，单独或复配[7]与PDA培养基混合制成含有不同浓度药剂的培养基，以加入等量无菌水的PDA培养基为空白对照。每处理3次重复。各含药培养基接种WZ1菌株菌饼，20 ℃恒温培养7 d后，采用十字交叉法测量菌落直径。采用农药室内生物测定数据处理系统(PBT)对各药剂试验结果进行统计分析，获得各药剂对菌株的毒力回归方程、抑制中浓度(EC50)、抑制90%浓度(EC90)、相关系数(r)等。

2 结果与分析

2.1 症状及发病规律自2018年12月中旬开始，在万州地区尤力克柠檬的叶片上发现了零星点状病斑；2019年1—2月，田间开始出现大面积叶片枯萎、大量落叶，随后枝条上的病斑逐渐扩展，导致整枝干枯，因而造成大量落果。病情发生非常迅速。2019年3月下旬左右，万州区白羊、黄柏和太龙3个镇(乡)共10个村的尤力克柠檬种植区，叶片基本全部落光，枝条大部分枯死，发病区域面积约达100 hm2。在患病柑桔叶片上，可见明显的圆形或椭圆形病斑，病斑中部为浅褐色凹陷，外圈深褐色并伴有黄色晕圈；在枝条上，呈现为眼状轮纹枯萎病斑，病斑扩展后导致整个枝条枯死，随后落叶、落果(见图1)。

注：A—C 尤力克柠檬，D—F 纽荷尔脐橙，拍照时间2019年3月。图1 重庆万州疑似柑桔轮斑病的田间症状

2.2 病原菌鉴定在PDA培养基上，分离菌株(WZ1)的菌落边缘光滑，气生菌丝生长较旺盛。菌丝最初为白灰色或灰色，外圈为浅白色或浅黄色，后逐渐整体变成灰褐色、靠近中心少量白灰色，菌丝成棉絮状且贴壁伸展。培养基背面最初为浅奶黄色，后逐渐产生深黑褐色圆圈，并不断扩展至全黑。长时间培养菌株的培养基正面或背面会出现深黑褐色菌核。气生菌丝隔膜明显，产孢菌丝同气生菌丝相同。在PDA培养基上，产生少量小型分生孢子，孢子呈椭圆形或长椭圆形，顶端钝圆，向一侧稍有弯曲；不产生厚垣孢子和刚毛(见图2)。

注：A—B 菌落正、反面， C—D菌丝及其隔膜， E小型分生孢子。图2 分离菌株(WZ1)的形态特征

将分离菌株(WZ1)接种在离体尤力克柠檬上，叶片出现中部凹陷深色、外圈伴有黄色晕圈的病斑，与田间症状一致；枝干上出现棕色病斑并逐渐扩大；果实出现水浸状凹陷(见图3)。从病斑上重新分离的菌株与接种菌株，在形态和ITS序列信息上一致。

图3 分离菌株(WZ1)对尤力克柠檬离体组织的致病性

从重庆万州尤力克柠檬患病样品中分离得到3株菌株(WZ1、WZ2、WZ3)，在北京柠檬患病样品中分离得到1株菌株(BJNM1)，在纽荷尔脐橙患病样品中分离得到1株菌株(NHRQC1)。将测得的各菌株ITS序列放于NCBI进行BLAST分析，5株菌株与Pseudofabraeacitricarpa(KR859281.1)的相似度为100.00%。基于ITS1/ITS4序列构建系统进化树，发现WZ1和WZ2聚在一起，并且与陕西城固柑桔轮斑病的病原菌SXL1(JN601676.1)处于不同分支；WZ3和BJNM1、NHRQC1聚在一起，且与SXL1(JN601676.1)处于同一分支(见图4)。

注：利用Kimura 2-parameter模型进行N-J分析；LZ-2012 SXL1 JN601676.1 Cryptosporiopsis sp. 后被定名为Cryptosporiopsis citricarpa [1]，再被更名为Pseudofabraea citricarp [5]。图4 重庆万州疑似柑桔轮斑病样品5株分离菌株基于ITS1/ITS4序列的系统进化树

2.3 分离菌株的致病性采用无伤处理接种时，离体叶片、枝条和果实上无病斑形成。在所有致伤处理接种的离体材料上，均可形成明显病斑。由此推测，该病原菌是通过伤口侵染植物。在叶片上，正面针刺10针接种形成的病斑最大，反面2针接种形成的病斑最小。枝条去皮接种后，去皮处产生明显的褐色病斑。果实去皮接种后，沿着去皮部位四周会形成透明水浸状不规则的病斑，不向海绵层扩展。采用针刺10针致伤接种的果实，针刺处及其四周微微向内凹陷，果实表皮形成圆形深褐色病斑，手按压明显感觉果斑处变硬，切开病斑表层，可见果实海绵层褐变。

WZ1菌株对万州地区规模种植的8个柑桔品种的叶片、枝和果均有致病性。接种12 d时，不同品种和不同组织材料之间的致病性均存在明显差异。WZ1菌株接种12 d后，叶片上的病斑直径以塔罗科血橙、W·默科特桔橙、纽荷尔脐橙显著大于其他品种，枝条上的病斑直径以W·默科特桔橙等6个品种显著大于红桔和纽荷尔脐橙，果实上的病斑直径以塔罗科血橙显著大于其他7个品种。塔罗科血橙在叶、枝和果实上的病斑均较大，是最易受害的品种(见表1)。

表1 WZ1菌株对8个柑桔品种不同离体材料的致病性 mm

菌株WZ1接种在昭通苹果和砀山酥梨果实上4 d后，出现圆形深黑褐色偏棕病斑(图5)，病斑向内微凹陷，轻按病斑处发现果实质地变得软，果皮易破，果实剖面可见明显U型腐烂。病斑会持续扩大，8 d时，砀山酥梨上病斑直径达9.49 mm，昭通苹果上病斑直径为3.76 mm。

图5 WZ1菌株对苹果(左)和梨(右)果实的致病性(接种4 d)

2.4 常见杀菌剂对WZ1菌株的毒力供试杀菌剂对WZ1的菌丝生长均有一定程度的抑制作用(见表2)。EC50值小于3 mg/kg且EC90值小于50 mg/kg的杀菌剂有以下10种：450 g/L咪鲜胺 EC、50%甲基硫菌灵 SC、30%碱式硫酸铜 SC、50%啶酰菌胺 WG、11.5%吡唑嘧菌脂 EC、86.2%氧化亚铜 WP、50%醚菌酯WP、3%噻霉酮 ME、40%腈菌唑WP、99%噁霉灵 DP。这些杀菌剂对菌株WZ1的毒力较强，且长期、多次使用，菌株也不易产生耐药性。EC50值小于3 mg/kg，但EC90值大于50 mg/kg的杀菌剂有以下6种：37%苯醚甲环唑 WP、60%唑醚·代森联 WP、25%嘧菌酯 SC、250 g/L戊唑醇 EW、75%肟菌·戊唑醇 WG、12.5%烯唑醇 WP。如果长期、多次使用这些杀菌剂，菌株可能会产生耐药性。46%氢氧化铜 WP、70%丙森锌 WP、80%克菌丹 WP、80%代森锰锌 WP、65%代森锌 WP的EC50值在10 mg/kg和40 mg/kg之间，99%矿物油EC的EC50值大于200 mg/kg。这几种杀菌剂不及其他药剂效果理想，但也对菌株存在抑制作用，可用于保护嫩梢幼叶。

表2 供试杀菌剂对Pseudofabraea citricarpa WZ1菌株的室内毒力

为了提高药剂对菌株的敏感性，降低菌株产生抗性的风险，减少用药量，进行了杀菌剂复配筛选。试验结果看出，80%代森锰锌 WP分别与50%啶酰菌胺 WG、37%苯醚甲环唑WP复配使用时，EC50值均小于1.2 mg/kg。其中，80%代森锰锌 WP与50%啶酰菌胺 WG 1∶64复配效果最佳，EC90值为7.11 mg/kg。80%克菌丹 WP与37%苯醚甲环唑 WP 1∶1复配也可以达到类似的效果，EC50值和EC90值分别为0.17和13.79 mg/kg。冬季清园时，植株会有大面积的创口，防控需同时使用清园保护药剂和杀菌剂。99%矿物油 EC和80%代森锰锌 WP 1∶50复配使用时，EC50值和EC90值分别为10.81和6 487.41 mg/kg(见表3)。

表3 复配药剂对P. citricarpa WZ1菌株的室内毒力

3 讨论

柑桔轮斑病最初在陕西城固的温州蜜柑和金柑上被发现，2012年被首次报道[1-2]。柑桔轮斑病的病原菌主要侵染柑桔植株的叶和枝，造成患病柑桔大量枯叶、枯枝、落果，严重时会造成果园毁园，带来巨大的经济损失[1]。柑桔轮斑病的病原最初被鉴定为拟隐壳孢属的一个新种，并被命名为CryptosporiopsiscitricarpaL. Zhu, K. D. Hy de & H.Y. Li[1]，2014年林惠娇等[4]根据分子生物学数据将该病原菌归入Neofabraea属，2016年Chen等[5]将其更名为Pseudofabraeacitricarp。2018年，基于SCAR标记的P.citricarp快速鉴定法被开发出来[8]。2019年，P.citricarpa转录组学和蛋白组学数据分析结果被报道[9]。本试验通过对患病柑桔样品进行鉴定，确定重庆万州地区近年新发生的疑似柑桔轮斑病的致病菌为Pseudofabraeacitricarpa，园区大面积发生的就是柑桔轮斑病。自2012年报道在陕西城固县的温州蜜柑和金桔上发现柑桔轮斑病后[1-2]，这是首次在新地区、新品种上的鉴定报道。病原菌的鉴定结果显示，从万州分离得到的柑桔轮斑病菌株和陕西城固的菌株在形态和分子序列[1-2]上均有差异；致病性测试结果显示，重庆菌株对柑桔枝、叶、果均有致病性，与陕西菌株[1-2]有所不同。

室内离体测试结果显示，WZ1菌株可侵染万州地区规模种植的8种柑桔的叶、枝和果。相比叶片和果实，菌株对枝条的致病性更强，在枝条上发病更快速、明显。这也与田间的发病情况类似[1-3]。田间，枝条上着生叶片和针刺的部位病斑最多，且病斑会持续扩大，随后叶片从基部向尖部开始枯萎，直至整枝枯萎、叶枯至掉落。离体尤力克柠檬不及田间尤力克柠檬发病严重，可能是因为园区内植株因感染黄化脉明病毒导致整个树体衰弱[10-11]，接着柑桔轮斑病菌在弱树上暴发。由此推测，植株患其他病害更易感染柑桔轮斑病，或者是感染柑桔轮斑病后，植株会多种病害一起发病。除了已确定患柑桔轮斑病菌的品种外，万州的多种杂柑种植区内也发现了柑桔轮斑病。这表明万州地区柑桔种植园有暴发柑桔轮斑病的风险。该病害一旦扩展，将会造成毁园，带来不可逆转的巨大损失。种植塔罗科血橙、W·默科特桔橙、纽荷尔脐橙的园区，尤其需要高度重视，做好防控准备。值得警惕的是，柑桔轮斑病菌除侵染柑桔外，还可侵染苹果和梨。WZ1菌株在昭通苹果上形成的病斑，与明孢盘菌属引起的苹果牛眼果腐病症类似但又不同[12-14]，WZ1菌株在昭通苹果和砀山酥梨上形成病斑的速度更快、病斑扩大更快、症状更明显。

化学杀菌剂是目前田间防控柑桔轮斑病的主要方法[1-3]。2012年朱丽[1]研究发现，室内苯醚甲环唑和咪鲜胺对柑桔轮斑病菌有抑制效果。本试验通过室内毒力测定试验发现，甲基硫菌灵、噻霉酮、醚菌酯、腈菌唑、碱式硫酸铜、吡唑嘧菌脂、啶酰菌胺、氧化亚铜、噁霉灵等杀菌剂，或是代森锰锌与啶酰菌胺复配、克菌丹与苯醚甲环唑复配，都对WZ1菌株生长有较好的抑制效果，可以进一步用于田间试验。

柑桔轮斑病容易暴发成灾，一旦在田间发现患病植株，应及时处理患病组织和喷洒杀菌剂。针对柑桔轮斑病菌低温生长的特点，春、秋新梢抽发期是生产上进行防控的关键期。秋季应喷洒药剂保护秋梢尤其是晚秋梢；冬季加强清园，修剪病枝并喷洒保护剂和杀菌剂；春季新梢抽发前喷洒杀菌剂降低病原菌基数。