异鼠李素抑制卵清蛋白诱导的哮喘小鼠肺部炎症*

朱 敏， 赵丽敏， 王 培， 肖亚丽

［河南省人民医院（郑州大学人民医院）呼吸与危重症医学科，河南郑州450003］

哮喘是一种由多种炎症细胞、细胞组分及神经递质参与的气道慢性非特异性炎症［1］。过往研究发现哮喘的发病机制与辅助性T 细胞（helper T-cell，Th）1 和Th2 的异常分化与功能异常引起的继发性的炎症因子表达增多和免疫调节机制失调密切相关［2］。目前，支气管哮喘的治疗以抗炎、药物改善症状和免疫治疗为基本治疗方法［3］。

异鼠李素（isorhamnetin，Iso）主要来源于胡颓子科植物沙棘的果实和银杏提取的黄酮类化合物，也是槲皮素的直接代谢产物。研究发现，异鼠李素有内皮保护、抗动脉粥样硬化、抗心肌缺血、降血压、抗血栓及血小板凝集、抗氧化等多种心脑血管保护作用，同时具有抑制脂肪细胞分化、抗肿瘤、降糖、抗炎和抗病毒等多种作用［4-5］。但是目前关于异鼠李素在哮喘中作用的研究还比较少，本实验通过卵清蛋白（ovalbumin，OVA）诱发小鼠哮喘模型，研究异鼠李素对哮喘小鼠肺炎症的作用及机制。

材 料 和 方 法

1 实验动物和主要试剂

32 只 6～7 周龄 SPF 级雄性 BALB/c 小鼠（20.5±2.1）g 由河南省实验动物中心提供，常规饲养于SPF动物房，所有小鼠自由饮水饮食。动物合格证号为SCXK（豫）2017-0001。

异鼠李素（纯度：99%）购于成都普瑞法科技开发有限公司；OVA 购于 Sigma；HE 和 PAS 染色试剂盒购自上海歌凡生物科技有限公司；半胱氨酰白三烯1（cysteinyl leukotriene 1，CysLT1）、半胱氨酰白三烯受体1（cysteinyl leukotriene receptor 1，CysLTR1）、白细胞介素（interleukin，IL）-4、IL-5、IL-13 和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的ELISA试剂盒均购自上海恒远生物技术发展有限公司；抗活化T 细胞核因子4（nuclear factor of activated T cells 4，NFATc4）抗体、抗细胞间黏附分子 1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）抗体、抗血管细胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）抗体和 GAPDH 均购自 Thermo Fisher Scientific。

2 方法

2.1 动物模型的制备及药物处理 32 只小鼠随机分为正常对照组（control 组）、哮喘模型组（OVA组）、异鼠李素低剂量（50 mg/kg）处理组（OVA+50 mg/kg Iso 组）和异鼠李素高剂量（150 mg/kg）处理组（OVA+150 mg/kg Iso 组），每组各8 只。采用OVA致敏并用OVA 激发的方法制备哮喘小鼠模型，除正常对照组外，其余组小鼠在实验第1 天和第7 天分别腹腔注射OVA 抗原液0.2 mL 致敏，在第15 天开始将小鼠置于密闭透明容器内给予10 g/L OVA雾化，每天30 min，连续激发刺激2 周；正常对照组给予等体积生理盐水雾化。异鼠李素处理于实验第15 天起在雾化前30 min 分别腹腔注射异鼠李素50 mg/kg 和150 mg/kg，模型组和正常对照组采用相同容积的生理盐水腹腔注射。在最后一次OVA 雾化24 h 后，用3%戊巴比妥钠（1 mL）腹腔注射处死动物。

2.2 支气管肺泡灌洗 小鼠处死后，仰卧位固定，经气管插管，用生理盐水缓慢灌洗左肺6 次，每次5 mL，收集灌洗液后，4 ℃下1 500 r/min 离心10 min 后取上清液，在-20 ℃冰箱保存。

2.3 组织病理学检测 解剖小鼠取出右肺下小叶，用4%多聚甲醛固定后，石蜡包埋切片，分别行HE和PAS染色，观察肺部组织的病理学改变。

2.4 ELISA 检测支气管肺泡灌注液（broncho-alveolar lavage fluid，BALF）中的细胞因子 参照ELISA试剂盒说明，分别检测 BALF 中 CysLT1、CysLTR1、IL-4、IL-5、IL-13和TNF-α的含量。

2.5 免疫组织化学染色 制备5 μm 肺组织石蜡切片，免疫组织化学法（immunohistochemistry，IHC）检测NFATc4的表达，在400倍显微镜下观察并拍照。

2.6 Western blot 检测蛋白水平 取右肺组织100 mg 放入试管，剪碎，加入裂解液裂解1 h，12 000 r/min离心15 min，取上清液后用Bio-Rad蛋白定量试剂盒测蛋白浓度，分别取50 μg 蛋白样本经SDSPAGE 分离蛋白后，转至硝酸纤维膜上，5%脱脂奶粉溶液封闭2 h，加Ⅰ抗（包含抗 ICAM-1、VCAM-1 和NFATc4抗体，稀释比例为1∶1 000）于37 ℃摇床上孵育2.5 h，PBST洗涤后，加Ⅱ抗（1∶1 000）于37 ℃摇床上孵育0.5 h。PBST 洗涤后用ECL 发光显影，以GAPDH 为内参照，用Bio-Rad 凝胶成像分析仪检测染色条带强度。

3 统计学处理

用SPSS 17.0 统计软件进行分析。数据均采用均数±标准差（mean±SD）表示。多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用SNK-q法进行检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 各组小鼠肺组织病理学变化

HE 和PAS 染色结果发现，对照组小鼠支气管、小动脉及肺泡结构清晰，支气管上皮细胞排列整齐，无血肿和炎症细胞浸润；模型组小鼠支气管上皮细胞增厚，有大量炎症细胞浸润，支气管周围充血；异鼠李素高、低剂量组肺组织炎症较模型组减轻，镜下可见炎症细胞浸润减少，充血水肿改善，见图1。

Figure 1.Pathological changes of mouse lung tissues by HE staining and PAS staining.The scale bar=50 μm.图1 各组小鼠肺组织病理学变化

2 CysLT1和CysLTR1水平的检测

与正常对照组相比，模型组BALF 中CysLT1 和CysLTR1 含量显著增加（P＜0.01）；与模型组相比，异鼠李素低、高剂量组CysLT1 和CysLTR1 含量均显著减少（P＜0.05），见图2。

Figure 2.The levels of CysLT1 and CysLTR1 in BALF of each group analyzed by ELISA.Mean±SD. n=8.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs OVA group.图2 各组BALF中CysLT1和CysLTR1水平

3 IL-4、IL-5、IL-13和TNF-α在BALF中的含量

与正常对照组相比，模型组BALF 中IL-4、IL-5、IL-13 和TNF-α 含量显著增加（P＜0.01）；与模型组相比，异鼠李素低、高剂量组BALF 中IL-4、IL-5、IL-13和TNF-α含量均显著减少（P＜0.05），见图3。

Figure 3.The levels of IL-4，IL-5，IL-13 and TNF-α in BALF analyzed by ELISA.Mean±SD. n=8.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs OVA group.图3 各组BALF中IL-4、IL-5、IL-13和TNF-α水平的变化

4 异鼠李素抑制OVA 激活的calcineurin/NFATc4通路

与正常对照组相比，模型组NFATc4、ICAM-1 和VCAM-1 蛋白表达均显著增高（P＜0.01）；与模型组相比，异鼠李素低、高剂量组NFATc4、ICAM-1 和VCAM-1蛋白表达均显著降低（P＜0.05），见图4。

讨 论

哮喘的发病机制与Th1/Th2 细胞的异常分化以及调控比例失衡有关［6-7］。由Th2 细胞分泌的细胞因子，如 IL-4、IL-5 和 IL-13 等，可诱导嗜酸性粒细胞大量聚集，从而辅助B 细胞产生IgE，介导体液免疫应答及Ⅰ型变态反应［8］。半胱氨酸白三烯（cysteinyl leukotrienes，CysLTs）通过其受体 CysLTR1 可促使嗜酸性粒细胞聚集，促进气道黏液分泌、支气管收缩和增加气体交换障碍，最终引起气道重塑，是哮喘发病过程中最重要的炎症介质之一［9-10］。本研究结果发现哮喘模型组 IL-4、IL-5、IL-13、CysLT1 和 CysLTR1表达显著高于正常组，说明哮喘小鼠Th2 细胞介导的免疫反应亢进，异鼠李素治疗显著降低哮喘小鼠IL-4、IL-5、IL-13、CysLT1 和CysLTR1 的表达，表明异鼠李素可以显著抑制哮喘中Th2 细胞介导的免疫应答，改变Th1/Th2 细胞平衡，从而发挥抑制炎症反应的作用。

Figure 4.The expression of calcineurin-NFATc4 signaling pathway-related proteins in lung tissues of each group.A：NFATc4 positive cells in various groups by immunohistochemistry detection（the scale bar=50 μm）；B：the results of Western blot for determining the protein expression of ICAM-1，VCAM-1 and NFATc4 in the lung tissues.Mean±SD. n=8.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs OVA group.图4 各组肺组织中calcineurin-NFATc4信号通路相关蛋白的表达

血管内皮异常是哮喘过程中炎症反应的重要环节，calcineurin/NFATc4 是血管内皮细胞异常激活和炎症反应的重要通路［11-13］。哮喘发病过程中会有大量的 TNF-α 产生［14］，过往研究发现 TNF-α 可诱导NFATc4 向细胞核内转移，进而使得ICAM-1 和VCAM-1 在血管内皮上的表达显著增加［15］。本实验中，哮喘模型组TNF-α、NFATc4、ICAM-1 和VCAM-1表达显著高于正常组，异鼠李素治疗显著降低哮喘小鼠 TNF-α、NFATc4、ICAM-1 和 VCAM-1 表达，表明异鼠李素可能是通过calcineurin/NFATc4 通路来抑制哮喘小鼠的肺炎症反应的。

综上所述，本研究通过异鼠李素治疗OVA 诱发的哮喘模型小鼠，证明其可以抑制哮喘小鼠肺炎症反应，其机制可能与抑制calcineurin/NFATc4 通路活化有关。