AIM2基因沉默对糖尿病大鼠心肌损伤的影响机制*

熊凌，郭昆全，宋文英

(1.湖北医药学院附属国药东风总医院 内分泌科，湖北 十堰 442000；2.陕西省人民医院 内分泌科，陕西 西安 710068)

糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)的特征是糖尿病患者心室肌的结构和功能异常与冠心病或高血压无关。慢性高血糖症介导的活性氧(reactive oxygen species，ROS)在DCM的病理生理进程和组织损伤中起着至关重要的作用，ROS激活了一系列细胞因子和炎症相关因子，这些因子在DCM的发展中促进心肌细胞死亡和纤维化[1-2]。γ-糖体参与糖尿病的致病性进展，但尚不清楚DCM时，与黑色素瘤2基因(absent in melanoma 2，AIM2)相关的γ-糖体活性缺乏的作用和潜在机制[3]。AIM2基因编码的AIM2蛋白是一种在DNA或特定刺激存在下能激活炎症小体的成分蛋白，该蛋白能够与凋亡样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)形成平台，并激活半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)，进一步导致白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和白细腻介素18(interleukin-18，IL-18)的成熟，从而诱发细胞炎症和凋亡[4-8]。本研究旨在探究AIM2基因沉默通过抑制炎性小体信号通路减轻糖尿病大鼠心肌损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物及主要试剂 60只洁净级Sprague-Dawley大鼠[北京大学动物试验中心，动物许可证号为SCXK(京)2020-0017]，改良Eagle培养基(上海碧云天公司)、RPMI-1640培养基(上海碧云天公司)、青霉素和链霉素(美国Hyclone 公司)、胎牛血清(杭州四季青公司)，小鼠抗大鼠AIM2单克隆抗体、小鼠抗大鼠ASC单克隆抗体(Sigma公司，美国)，小鼠抗大鼠pro-IL-1β单克隆抗体(Sigma公司，美国)、小鼠抗大鼠IL-1βp17单克隆抗体(Sigma公司，美国)、小鼠抗大鼠GSDMD-N单克隆抗体(Sigma公司，美国)、小鼠抗大鼠胱天蛋白酶单克隆抗体(Sigma公司，美国)、小鼠抗大鼠胶原蛋白Ⅲ单克隆抗体(Sigma公司，美国)、小鼠抗大鼠胶原蛋白Ⅰ单克隆抗体(Sigma公司，美国)、小鼠抗大鼠MMP2单克隆抗体(上海碧云天公司)、小鼠抗大鼠MMP9单克隆抗体(上海碧云天公司)、荧光(Cy3)标记的羊抗小鼠IgG(上海碧云天公司)以及抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶多克隆抗体(南京Bioworld公司)。

1.1.2主要仪器 恒温CO2培养箱(美国Thermo公司)、SW-CJ-2FD超净工作台(中国苏州净化)，台式超低温高速离心机(美国Beckman Couler公司)、CKX41倒置显微镜(日本Olympus公司)及恒温培养震荡器(中国智城分析公司)。

1.2 方法

1.2.1实验分组 将所有大鼠保持在23 ℃的环境中。大鼠饲养条件：室温，相对湿度控制于50%左右，12 h光照与12 h黑夜交替，每天正常自由饮水进食，所有大鼠正常活动。动物实验获得医院动物实验研究委员会的批准，并按照《实验动物管理和使用指南》第8版中规定的标准进行。大鼠在适应性饲养7 d后，将其随机均分为对照组、模型组、模型+shNC组和模型+shAIM2组。对照组接受基础饮食，而其他3组接受高脂肪(16%脂肪和0.30%胆固醇)饮食，喂养4周后进行腹膜内胰岛素耐受性试验(IPITT)和腹膜内葡萄糖耐受性试验(IPGTT)，确定胰岛素抵抗率。后3组大鼠采用腹腔1次性注射40 mg/kg链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病，注射7 d后检测空腹血糖(FBG)水平，若FBG>11.1 mmol/L则认为糖尿病模型构建成功[9]。模型组、模型+shNC组和模型+shAIM2组大鼠于注射STZ第8周，心肌分别转染空质粒、shRNA阴性对照NC-shRN(序列为5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′)、AIM2-shRNA(序列为5′-GGTCACCAGTTCCTCAGAG-3′)。注射2周后用荧光显微镜判断转录效率。

1.2.2心脏功能检测 AIM2-shRNA转染大鼠后4周进行超声心动图评估，使用带有RMB710换能器的Vevo770成像系统测量大鼠超声心动图的参数：左心室舒张末期容积(LVEDD)、左心室射血分数(LVEF)、峰E与峰A之比(E/A)、间期(e′)至晚期(a′)、舒张期速度比(e/a)、峰值E与早期(e′)之比(E/e′)及缩短分数(FS)。

1.2.3代谢指标检测 于实验第20周各组大鼠取血检测FBG、总胆固醇、甘油三酯、胰岛素和胰岛素敏感性指数。

1.2.4检测大鼠心肌纤维化程度 造模后20周处死大鼠后解剖心脏组织，用4%多聚甲醛固定、石蜡包埋并切成4 μm厚的切片，使用苏木精-曙红(H&E)、Masson染色和天狼星红染色观察心肌组织的纤维化程度：胶原蛋白Ⅲ、胶原蛋白Ⅰ、IL-1β和AIM2等抗体组织切片在4 ℃下孵育过夜、磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤、37 ℃下于二抗中孵育30 min[10]；染色后每张切片选取4个不重叠无血管视野(400×)，采用Image-Proplus5.0图像扫描软件进行图像分析，计算心肌胶原容积分数(CVF)，并以此作为心肌纤维化程度的量化指标，CVF(%)=胶原面积/全视野面积×100%。

1.2.5心肌AIM2、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ、MMP2和MMP9蛋白表达 使用SDS-PAGE电泳分离大鼠心肌蛋白质，转移到聚偏二氟乙烯膜上，使用5%的脱脂牛奶在室温下封闭膜1 h，加入小鼠抗大鼠AIM2单克隆抗体(1 ∶100)、小鼠抗大鼠ASC单克隆抗体(1 ∶100)、小鼠抗大鼠pro-IL-1β单克隆抗体(1 ∶100)、小鼠抗大鼠IL-1βp17单克隆抗体(1 ∶100)、小鼠抗大鼠GSDMD-N单克隆抗体(1 ∶100)、小鼠抗大鼠胱天蛋白酶单克隆抗体(1 ∶100)、小鼠抗大鼠胶原蛋白Ⅲ单克隆抗体(1 ∶100)、小鼠抗大鼠胶原蛋白Ⅰ单克隆抗体(1 ∶100)、小鼠抗大鼠MMP2单克隆抗体(1 ∶100)、小鼠抗大鼠MMP9单克隆抗体(1 ∶100)，在4 ℃下孵育过夜，加入荧光(Cy3)标记的羊抗小鼠IgG(1 ∶100)在室温下孵育1 h；用Gel-Pro图像分析软件分析蛋白条带的灰度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 代谢指标

糖尿病模型构建20周时，糖尿病大鼠的FBG、总胆固醇、甘油三酯水平、胰岛素含量和胰岛素敏感性指数提高(P<0.05)。AIM2抑制对总胆固醇、甘油三酯、空腹血糖、胰岛素敏感性指数和实验结束时胰岛素含量无影响(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯、胰岛素水平及敏感性指数

2.2 心脏功能

与对照组相比，模型组大鼠表现出心脏功能障碍，表现为LVEF、FS、E/A比和e′/a′比降低(P<0.05)，LVEDd和E/e′比增加(P<0.05)；与模型组和模型+shNC组相比，AIM2-shRNA(模型+shAIM2组)的LVEF、FS、E/A比和e′/a′比增加，E/e′和LVEDd降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠的心脏功能比较

2.3 心肌AIM2蛋白表达

与对照组比较，模型组大鼠心肌AIM2蛋白水平增加，AIM2-shRNA(模型+shAIM2组)的抑制作用下调了糖尿病诱导的AIM2表达的增加(P<0.05)。见图1A。与对照组比较，模型组表现出偏心室肥大和较高的心肌细胞宽度，但通过AIM2-shRNA治疗(模型+shAIM2组)得到缓解，见图1B。提示，AIM2抑制作用减弱了模型大鼠的心脏重塑。

注：A为AIM2蛋白和β-actin蛋白的定量表达结果(Western blot)，B为AIM2蛋白的免疫组化实验结果(100×)。

2.4 AIM2对心肌纤维化的作用

与对照组比较，模型组心肌有更高的细胞外基质沉积，但通过shRNA处理(模型+shAIM2组)得以缓解，差异有统计学意义(P<0.05)(图2A)。与对照组比较，模型组表现出胶原蛋白I和胶原蛋白Ⅲ的过表达，并且AIM2抑制降低了2种蛋白质的表达水平,差异有统计学意义(P<0.05)(图2B)。与对照组比较，模型组大鼠中通过shRNA-AIM2转染抑制了MMP2和MMP9的表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)(图2C)。提示AIM2抑制可预防糖尿病引起的心肌纤维化。

注：A为免疫组化实验结果(Masson染色,×100)，B、C为相关蛋白表达(Western blot)；(1)与对照组比较，P<0.05。

2.5 AIM2基因沉默通过抑制炎性小体信号通路在体内心肌细胞死亡中的作用

与对照比较，模型组、模型+shNC组中AIM2炎性小体、caspase-1和GSDMD的蛋白水平均升高，但被AIM2抑制下调，差异有统计学意义(P<0.05)(图3A)。与对照组比较，模型组、模型+shNC组心脏组织中TUNEL阳性细胞的比例增加，但是AIM2-shRNA处理减轻了这种现象，差异有统计学意义(P<0.05)(图3B)。

注：图A为相关蛋白定量表达(Western blot)；图B为免疫组化实验结果(天狼星红染色，×100)；(1)与对照组比较，P<0.05。

3 讨论

糖尿病性心肌病的特征是独立于冠心病和高血压的左心功能不全，是糖尿病患者心力衰竭的主要原因[11-13]，这项研究成功地在Sprague-Dawley大鼠中诱导了2型糖尿病模型，该模型显示出严重的代谢紊乱、心肌细胞死亡和纤维化增加以及心脏功能障碍。研究发现，糖尿病大鼠心脏组织中AIM2炎性小体和IL-1β的水平升高[14]。当沉默AIM2的表达时，糖尿病大鼠的心脏功能得到改善，这表明AIM2在DCM的进程中起着重要作用。因此，AIM2在糖尿病大鼠中被激活并促进DCM的发展。超声检测发现，AIM2基因沉默在一定程度上改善了糖尿病心肌病大鼠的心功能[15]。这些结果说明AIM2基因沉默可通过抑制炎症而减轻高糖诱导的心肌细胞损伤及心肌间质纤维化病变。在本研究中，糖尿病大鼠表现出严重的代谢紊乱，这与以前的研究一致。但是，通过监测大鼠AIM2基因沉默模型中血糖的变化，本研究发现AIM2对缓解系统性代谢紊乱几乎没有影响。因此，本研究得出结论，AIM2炎性小体在DCM中的作用不是通过全身作用。在糖尿病条件下，高血糖症诱发的促炎细胞因子可导致心肌组织持续的炎症状态，并促进心脏的功能障碍[16]。除了其促炎作用外，AIM2在炎症中也起着重要作用，这是一种依赖caspase-1的发炎性程序性细胞死亡，膜的穿孔促进了细胞中蛋白质的分泌，这导致了由细胞质肿胀引起的细胞破裂。同样，炎症的开始会导致细胞核中的DNA损伤。先前关于DCM中心肌细胞死亡的研究主要集中在细胞凋亡的作用上，但关于细胞凋亡作用的研究较少。研究表明，细胞凋亡在糖尿病性心肌病的进展中起着重要作用，NLRP3，microRNA-9和microRNA-30d调节DCM中的细胞凋亡水平[17-19]。作为一种先天免疫受体，AIM2最初位于人类黑素瘤细胞中。最近的研究表明，巨噬细胞中对AIM2的抑制会激活细胞凋亡。AIM2可直接与dsDNA结合并被，激活的AIM2可促进炎症小体的募集并进一步激活GSDMD-N。本研究发现GSDMD-N的水平在炎症过程中起着重要的作用[20]，在AIM2基因沉默后降低了水平，并且糖尿病性心肌病的进展得以减少。

综上所述，沉默AIM2基因抑制了炎症小体caspase-1的表达，降低了炎症水平，临床上可通过抑制炎性小体信号通路来减轻糖尿病大鼠心肌的损伤。