维吾尔族烟雾病病人血清miRNA的异常表达及其基因分析

李海蒙 周广平 水 政 俞 辉 孙育海 洪 波

烟雾病是一种原因不明、以颅内大动脉闭塞伴颅底异常血管网生成为特点的疾病[1]。烟雾病的发生是多种因素共同作用的结果，具有易感基因的人群，在感染、炎症在内的多种因素作用下，导致颅内大动脉内膜增厚伴纤维增生，最终导致相关血管狭窄甚至闭塞，并促使代偿血管异常扩张、增生，其中相关血清miRNA 的表达在其发生过程中起重要的作用。由于烟雾病的发病率具有明显的地区和种族差异，提示不同种族的致病基因和发病机制存在多样性[2]。目前，关于烟雾病的研究对象多集中在东亚人种[3]，而维吾尔族（简称维族）人群烟雾病的基因研究仍处于空白阶段。本文以维族烟雾病病人为研究对象，通过miRNA芯片技术筛选烟血清异常表达的miRNA，随后通过生物信息学方法分析跟烟雾病相关的基因，为维族烟雾病的诊治提供参考。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集2017 年2 月至2018 年8 月新疆莎车县人民医院救治的8 例维族烟雾病与8 例维族健康者（对照组）的血样。烟雾病均由脑血管造影证实且为双侧颈内动脉病变，排除文献已证明可以伴有烟雾病综合征的疾病（中枢神经系统感染、结缔组织病等）。两组性别、年龄及白细胞计数、血沉、血胆固醇水平等均无统计学差异（P＞0.05，表1），但烟雾病组血糖水平明显高于对照组（P＜0.05，表1）。8 例烟雾病临床表现见表2。本研究获得新疆喀什地区莎车县人民医院伦理委员会通过。

1.2 检测方法

1.2.1 采血 采集外周静脉全血约5 ml，30 min内以4 000转/min离心15 min，缓慢吸取上层血浆立即放置于-80 ℃冰箱保存后待测。

1.2.2 建立血清池 完成所有血浆收集后，每个标本取150 μl血浆充分混匀，形成1.2 ml血清池。

1.2.3 提取血清总RNA 从血清池中取500 μl 样本，加入500 μl TRIzol（美国Invitrogen 公司）充分旋涡震荡后室温静置5 min，使其充分裂解；再加入200 μl异丙醇，充分混匀，4 ℃、12 000 转/min 离心15 min后，吸取上清液1 ml；加入500 μl氯仿，摇匀，旋涡震荡30 s，室温静置3 min，然后4 ℃、12 000转/min离心15 min，吸取上层清液，加0.75 体积的异丙醇，摇匀后室温静置10 min，4 ℃、12 000 转/min 离心10 min；收集含RNA 的沉淀，用75%乙醇重悬沉淀，4 ℃、8 000转/min离心5 min，收集含RNA的沉淀，用300 μl DEPC水（美国Sigma公司）重悬沉淀待测。

1.2.4 测定RNA浓度 取1 μl含RNA的提取液，加入99 μl 的DEPC 水稀释。采用SMA3000 光度计检测，选择“RNA”，将RNA 稀释倍数设定为100。使用双蒸水反复清洗比色杯3次，加入100 μl的DEPC水调零。加入稀释好的RNA 提取液，开始检测，分别测量A280 nm 和A260 nm 的光密度（optic density，OD）值，A260/A280值在1.8～2.0，以保提取RNA的纯度。

表1 两组基线资料比较

表2 8例烟雾病临床表现

1.2.5 miRNA 测序及筛选 采用Exiqon miRCURY LNA microRNA 芯片（丹麦Exiqon 公司）高通量技术检测miRNA 表达谱。应用小芯片构建单分子阵列，桥式PCR扩增检测信号。PCR每个循环中将四种荧光标记的dNTP 和DNA 聚合酶添加到单分子阵列中，激光激发与dNTP 结合的标记荧光信号，并使用计算机化分析系统将光信号转换为测序碱基信息。通过标准化比较分析确定miRNA的最终读数。

1.3 生物信息学分析 使用GenePix pro V6.0 软件进行相关数据分析，通过每个探针点获得初始荧光强度值。标准化比较芯片之间的数据，重复芯片之间的数据分析，最终筛选出差异表达水平大于1.5或小于0.67倍的miRNA（P＜0.05）。将筛选出的差异表达的miRNA 利用targetscan 软件进行靶基因的预测和分析。得出的靶基因通过david 网站进行基因功能诠释和聚类分析、功能富集分析。

1.4 统计学分析 采用SPSS 19.0软件处理，计量资料以x±s表示，采用t检验；计数资料采用χ2检验；检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 差异表达miRNA 的筛选 根据miRNA 表达芯片的分析数据，初步结果发现54个miRNA 位点存在差异表达，其中上调28 个，下调26 个。结合相关文献报道，我们选择表达水平变化倍数R 在0.67～1.5 筛选差异表达的miRNA，筛选出差异明显的4 个miR⁃NAs，其中显著上调3 个，分别是miR-188-5p、miR-4284 及miR-5100；显著下调1 个，为miR-6277-3p。火山图显示明显差异表达的miRNA（图1）。

2.2 生物信息学分析 将上述差异表达的miRNA 分别在targentscan 网站上寻找靶基因，目标积分80 以上的靶基因及功能。将靶基因做交集分析后，得出相互交集的靶基因有7 个，分别为MEX3A、FBXL18，、FZD2、AAK1、KAT7、CACLR、PLA2R1。根据交集和靶标评分靠前的原则，锁定25 个靶基因，经David软件GO分析出前10个靶基因（表3）。这些基因主要参与细胞和酶的代谢、活化、转运及感染和炎症反应，具体包括X 染色体的激活、锌指蛋白、锌离子的结合、细胞内吞、蛋白代谢等。参考文献后发现，某些锌指蛋白和血管增生及新生血管形成有关，推测维吾尔族烟雾病发病可能和锌指蛋白有一定的相关性。

3 讨论

本文结果发现的miR-4284 是近年来新发现的miRNA，其表达水平上调可能预示颈内动脉狭窄。miR-4284 在下肢动脉硬化闭塞症病人血浆和血管组织中均明显上调，在缺氧缺血清诱导的主动脉平滑肌细胞中明显下调，缺氧缺血清诱导的脐静脉内皮细胞中明显上调[4]。

本文结果显示维族烟雾病病人miR-6722-3p表达下调。有研究报道烟雾病病人血浆hsa-mir-6722-3p和hsa-mir-328-3p的差异表达[5]，基因分析和传导通路分析显示在烟雾病发病过程中，可通过miRNA-基因表达网络调节内皮细胞生物学功能。

表3 生物信息学分析筛选出的主要靶基因名称及代码

图1 8例烟雾病差异表达miRNA的火山图

锌指蛋白含有短的我自折叠“指状”结构，并通过与Zn2+结合而稳定。本文筛选出的靶基因中包含2 种锌指基因，为ZFP91 和ZFP41，其中ZFP91 更值得关注，含有5个锌指结构域，同时具有转录因子特征性结构基序[6]。Xu 等[7]报道ZFP91 是一种E3 泛素连接酶，负责Lys 185的hnRNP的泛素化以及蛋白酶体降解。此外，ZFP91 可以促进pro-IL-ip 的产生和IL-1P的分泌[8]。我们推测，某种锌指基因（如ZFP91等）可能是维族烟雾病发病的靶基因，通过激活或抑制miRNA（如miR-188-5p 等），在烟雾病的炎症反应过程或血管内皮增生过程中，起着某种促进作用，但具体作用机制需进一步深入研究。

总之，遗传因素和环境因素可能通过复杂的机制在维族烟雾病发病中发挥重要作用。希望未来能制造出整合这些因素的烟雾病动物模型，进一步证实。此外，烟雾病相关基因miRNA等在循环血液中的变化仅特异性地累及颈内动脉系统，而全身其他血管却不受累，这种现象目前还无法完全解释。