lncRNA MIR4435-2HG的表达水平及甲基化状态与脑胶质瘤病理分级的关系

罗孝全 唐 辉 冯 浩 陈 兵 孙 谋

脑胶质瘤在临床组织学和遗传学上都具有较高的异质性，例如低级别胶质瘤普遍存在异柠檬酸脱氢 酶1（isocitrate dehydrogenases 1，IDH1）突 变[1]。lncRNA MIR4435-2H 是一种新的致癌基因[2]。本文探讨lncRNA MIR4435-2HG的表达水平及甲基化状态与脑胶质瘤病理分级的关系。

1 资料与方法

1.1 标本来源 选取2019年1～12月手术切除的脑胶质瘤组织110例，其中男51例，女59例；中位年龄52岁；低级别胶质瘤（WHO分级Ⅰ～Ⅱ级）65例，高级别胶质瘤（WHO 分级Ⅲ～Ⅳ级）55 例；IDH1 突变46例。另外选取颅脑损伤内减压术中切除正常脑组织20 例为对照，其中男13 例，女7 例；中位年龄50 岁。本研究经我院医学伦理委员的批准。

1.2 实时荧光定量PCR 法检测MIR4435-2HG 表达术中获取组织标本迅速置于液氮中，24 h 后放到-80 ℃长期保存。另外，所有病人初诊时采集血液样本，留取血清，置于-80 ℃保存。使用QIAamp Min⁃Elute Virus Spin 试剂盒 和Qiamp DNA/RNA FFPE 组织试剂盒（德国Qiagen公司）分别提取血清和石蜡包埋组织快中RNA。使用SensiFASTTM cDNA 合成试剂盒（美国Bioline 公司）对2μg RNA 进行逆转录反应，获得cDNA。以1μg 稀释后cDNA 为模板，用SYBR Green Master Mix 试剂盒（美国Bio-Rad 公司）制备qPCR 反应混合物。以GAPDH 作为内源性对照。基于2-ΔΔCT方法，MIR4435-2HG表达被标准化为内源性控制GAPDH。

1.3 MIR4435-2HG 基因启动子甲基化检测 使用EpiTect bisulfite 试剂盒（德国Qiagen 公司）进行亚硫酸氢钠处理，并用Wizard DNA 纯化树脂（美国Pro⁃mega 公司）对修饰后的DNA 样品进行纯化。使用200 ng DNA 进行甲基化特异性PCR（methylationspecific PCR，MSP）扩增。分别用甲基化或非甲基化DNA 序列的特异性引物来区分MIR4435-2HG 甲基化。PCR 产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳分离。仅出现甲基化引物的阳性扩增被解释为完全甲基化，同时出现甲基化和非甲基化引物的阳性扩增被视为部分甲基化。

1.4 统计学处理 利用SPSS 19.0软件分析；计量资料以x±s表示，采用t检验；计数资料采用χ2检验；采用受试者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲线分析鉴别效能；采用Kappa 值判断一致性，≥0.75为一致性好，0.40～0.75为一致性一般，＜0.4为一致性较差；检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 脑胶质瘤MIR4435-2HG 表达水平和甲基化状态 与对照组相比，脑胶质瘤组织和病人血清MIR4435-2HG 水平均明显增高（P＜0.05），而甲基化率明显降低（P＜0.05）。与低级别胶质瘤相比，高级别胶质瘤组织和病人血清MIR4435-2HG 水平明显增高（P＜0.05），而甲基化率明显降低（P＜0.05）。与IDH1 野生型胶质瘤相比，IDH1 突变型胶质瘤组织和病人血清MIR4435-2HG水平明显降低（P＜0.05），而甲基化率明显增高（P＜0.05）。见表1。

2.2 脑胶质瘤MIR4435-2HG 甲基化状态和表达量的关系MIR4435-2HG 甲基化组胶质瘤组织（1.83±0.64）和血清（1.51±0.38）MIR4435-2HG 水平明显低于非甲基化组（分别为2.95±0.87、2.12±0.51；P＜0.05）。Kappa 分析显示，脑胶质瘤组织MIR4435-2HG 甲基化率与其表达水平一致性良好（Kappa=0.782，P＜0.05），与血清MIR4435-2HG水平一致性一般（Kappa=0.636，P＜0.05）。

2.3 ROC 曲线分析结果 血清MIR4435-2HG 水平鉴别脑胶质瘤级别的曲线下面积为0.752（95%置信区间0.701～0.804），最佳截断值为1.98，灵敏度和特异度分别为65.0%和91.5%。见图1。

表1 脑胶质瘤lncRNA MIR4435-2HG表达水平及其基因启动子甲基化状态

图1 ROC曲线分析血清MIR4435-2HG水平鉴别诊断脑胶质瘤级别的效果

3 讨论

2016年，WHO首次将分子生物标志物与典型的组织学特征结合起来，以确定神经胶质瘤亚型以及恶性化程度[3]。MIR4435-2HG 是一种新发现的lncRNA。本研究发现脑胶质瘤组织和病人血清MIR4435-2HG 水平均明显高于对照组（P＜0.05）；并且，高级别胶质瘤组织和病人血清MIR4435-2HG水平升高更明显。这说明MIR4435-2HG 可能参与脑胶质瘤的发生，可能与胶质瘤病理分级有观。

2013 年，Cao 等[4]首次在肝细胞癌中发现MIR4435-2HG 呈低甲基化状态。Xu 等[5]证实MIR4435-2HG 可促进脑胶质瘤细胞增殖和侵袭活性，其作用机制可能是靶向miR-1224-5p/TGFBR2轴，进而驱动脑胶质瘤恶性化进程。Reon 等[6]通过Paris 和ribo-seq 数据，结合二级结构预测，在MIR4435-2HG 基因的3'端发现一个与蛋白结合的121 bp 的干环结构，通过一种需要发夹结构完整性的机制促进肿瘤细胞的侵袭。本研究发现MIR4435-2HG 启动子两个不同的区域检测到CpG位点，利用平行RNA 表达和DNA 甲基化数据以及Kappa 一致性分析，证实DNA 甲基化与MIR4435-2HG表达水平呈负相关，提示MIR4435-2HG的转录可能受到DNA甲基化的调控。

IDH 突变是胶质瘤发生的早期事件，与脑胶质瘤细胞的侵袭和迁移减弱、增殖减少等途径有关。IDH1R132H和IDH2R172K替换是最常见的情况，使IDH产生一种新的酶活性，催化α-KG生成一种抑制α-KG 依赖性酶的肿瘤代谢物，导致广泛的基因组DNA 甲基化[7]。本研究发现IDH1 突变型胶质瘤组织和病人血清MIR4435-2HG 表达水平明显低于IDH1 野生型胶质瘤，同时MIR4435-2HG 甲基化率明显增高。这说明MIR4435-2HG 甲基化上调可能与IDH1突变有关。

综上所述，脑胶质瘤，尤其是高级别胶质瘤，血清MIR4435- 2HG 水平普遍升高，检测血清MIR4435-2HG 水平有助于鉴别诊断脑胶质瘤级别。MIR4435-2HG转录受到DNA甲基化调控，并且与IDH1突变有关，但是具体的调控机制尚需要进一步研究。