3种自酸蚀粘接系统和轻度唾液污染对乳牙釉质及牙本质粘接耐久性的影响

骆池怡，彭楚芳，杨 媛，秦 满，王媛媛

(北京大学口腔医学院·口腔医院，儿童口腔科 国家口腔疾病临床医学研究中心 口腔数字化医疗技术和材料国家工程实验室 口腔数字医学北京市重点实验室，北京 100081)

乳牙树脂粘接修复是儿童口腔临床最常规的治疗之一，然而针对不同粘接系统对乳牙的粘接作用研究较少[1-4]。就乳牙树脂粘接修复治疗而言，操作步骤简便、受唾液污染影响小的粘接剂更为适用，自酸蚀粘接剂在这一点上契合临床需求。对自酸蚀粘接剂的研究大多集中在恒牙，对乳牙粘接性能的研究结论尚无统一定论[5-10]，本研究将比较3种临床上常见的自酸蚀粘接剂在乳牙釉质和牙本质粘接的表现，同时分析粘接界面老化后粘接强度的改变。

低龄儿童树脂粘接治疗过程中术野隔湿是一大难题，发生长时间或大量的唾液污染的情况下要求重新预备粘接界面进行再次粘接处理[11-12]。然而在有效隔湿情况下发生的一过性唾液污染如何处理尚无定论，Santschi等[5]发现粘接剂固化后发生唾液污染时即刻吹干，可恢复通用型粘接剂的即刻粘接强度。本研究将模拟粘接剂光固化后一过性唾液污染并即刻吹干的处理方法，评估不同自酸蚀粘接剂粘接强度的改变。

1 材料与方法

1.1 实验材料

将实验组依据不同的自酸蚀系统分为两步法自酸蚀粘接剂Clearfil SE Bond(SE 组，Kuraray Noritake Dental公司, 日本)、一步法自酸蚀粘接剂AdperTMEasy One (EO组，3M ESPE公司，美国)和通用型粘接剂Scotchbond Universal (SBU组，3M Deutschland公司，德国)3组。对照组采用AdperTMSingle Bond Plus(SL组，3M ESPE公司，美国)全酸蚀(格鲁玛酸蚀剂，Heraeus公司，德国)粘接系统。充填树脂为复合树脂Z250(A2色，3M ESPE公司，美国)。

根据操作说明书，4种粘接系统的操作简述如下：SE组：干燥牙齿粘接界面上均匀涂布预处理剂静置20 s，气枪吹干5 s，涂布粘接剂后轻轻吹匀，光照固化10 s。EO组：牙齿粘接界面加压涂抹粘接剂15 s，气枪吹干直至粘接面无液体残留，光照固化10 s。SBU组：保持粘接界面干燥，加压涂抹粘接剂20 s，轻轻吹薄粘接界面5 s，光照固化10 s。SL组：酸蚀剂酸蚀粘接界面15 s，用三用枪水汽冲洗10 s，吹干界面，轻轻加压涂抹粘接剂15 s，气枪吹干5 s，光照固化10 s。

1.2 唾液的采集

为了模拟临床上唾液污染的模式，且减少样本间的差异，每次采集同一个人在上午8点至9点之间空腹时的非刺激性唾液，并立即直接应用。

1.3 试样的制备

本研究通过了北京大学口腔医学院伦理委员会的批准(批件号：PKUSSIRB-201839145)。共收集了150颗临床因乳牙滞留拔除或自然脱落的无龋/浅龋乳牙，牙位包括乳切牙、乳尖牙和乳磨牙，用0.5%(质量分数)的氯胺水溶液(氯胺T粉，中国源叶生物公司)清洁和消毒后，储存在4 ℃蒸馏水中，6个月内使用。

乳磨牙的牙冠沿牙长轴方向使用慢速切割机(Buehler Iso MetⅡ-1180-250，Buehler公司, 美国)切割，获得颊、舌、近中、远中4个部分，每个乳磨牙可制成4个试样[13]，对乳前牙不做额外切割，所有试样均在体视显微镜下以40倍的放大倍数仔细检查是否完好。

将试样的待粘接面倒置于模具底，加入自凝树脂(新世纪公司，中国)包埋，脱模后得到240个仅暴露待粘接面的圆柱形釉质试样块。用600目碳化硅水砂纸打磨待粘接面15 s，以获得平坦的釉质表面。牙本质试样的制备方法相似，需打磨待粘接面至牙本质层，并用600目碳化硅水砂纸抛光15 s[14]。

根据不同的粘接系统(自酸蚀粘接剂： SE、EO、SBU；对照组全酸蚀粘接剂：SL)，两种污染状态(无或有唾液污染)以及两种储存条件，将240个乳牙釉质试样和240个牙本质试样均随机分为16组(n=15个/组)。

按第1.1小节中描述的操作方法应用粘接剂后，无唾液污染组的试样使用内径2.0 mm、高2.0 mm的标准模具堆塑复合树脂，并从顶部光固化20 s。有唾液污染组的试样在应用粘接剂光固化后，粘接界面上滴加6 μL的唾液，静置5 s后以相同的气压吹干，再行树脂堆塑，模具建样过程见图1。

A, the applied adhesive system for setting up the bonding sample; B, a drop of saliva (6 μL) placed on the defined bonding area to establish the contaminated sample.

1.4 储存条件

粘接即刻组：37 ℃蒸馏水中储存24 h；老化处理组：37 ℃蒸馏水中储存24 h后，在5 ℃和55 ℃水浴中循环5 000次，每一水浴中停留30 s。

1.5 剪切强度测试和断裂模式

将粘接试件固定于万能实验机(Instron 3367型，Instron公司, 美国)， 加载方向平行于粘接面，加载速度1 mm/min，记录粘接界面开裂时的最大载荷力，并计算剪切强度[最大载荷力(N)/粘接面积(mm2)]。

体视显微镜下(40倍)评估断裂模式，可分为粘接剂内断裂、牙体组织断裂、复合树脂内断裂和混合断裂(前三种失败模式的任意组合)。

1.6 扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)观察

每组取3个试样，垂直于粘接界面切割开，待观察面依次使用400、600、1 000和2 000目碳化硅水砂纸进行抛光，再用37%(质量分数)的磷酸酸蚀待观察面10 s，冲洗30 s后浸入5%(质量分数)次氯酸钠溶液中2 min[15]，在70%、80%、90%、99%(体积分数)乙醇溶液中系列脱水各5 min[16]。喷金后于SEM(JEOL JSM-7900F，JEOL公司，日本)下观察粘接界面[17]。

1.7 统计学分析

采用SPSS 21.0统计软件对数据进行统计分析。用三因素方差分析法分析不同粘接系统、唾液污染和储存条件对剪切强度的影响，以及这三个因素间的相互作用，采用Tukey-Kramer检验进行多重比较，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 乳牙牙釉质粘接

2.1.1剪切粘接强度 三因素方差分析结果显示，粘接系统(F=72.88,P<0.001)和唾液污染(F=51.61,P<0.001)对乳牙釉质的剪切强度均有显著影响，粘接系统与唾液污染间的相互作用差异也有统计学意义(F=3.92,P= 0.010)。储存条件对乳牙釉质的剪切强度没有显著影响(F=0.00,P= 0.952，表1)。Tukey检验发现，全酸蚀粘接剂SL组无污染条件下的即刻剪切粘接强度为(28.92±1.83) MPa，唾液污染条件下的即刻剪切粘接强度为(26.14±5.17) MPa，显著高于3种自酸蚀粘接剂，组间差异有统计学意义(P<0.01)。无污染条件下3种自酸蚀粘接剂的即刻粘接强度差异无统计学差异。EO有污染组的即刻剪切粘接强度为(11.88±3.17) MPa，显著低于其无污染组的即刻剪切粘接强度(19.57±3.89 MPa)，差异有统计学意义(P<0.01)。全酸蚀粘接剂SL组无污染老化后剪切粘接强度为(27.27±3.03) MPa，有污染老化后剪切粘接强度为(24.86±5.41) MPa，显著高于3种自酸蚀粘接剂，差异有统计学意义(P<0.01)。EO组有污染老化后剪切粘接强度为(11.90±3.98) MPa，显著低于其无污染的老化后剪切粘接强度(19.01±5.03) MPa和SE组有污染的老化后剪切粘接强度(17.72±4.13) MPa，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.1.2断裂模式 对乳牙釉质，SE、EO和SBU组的主要断裂模式是粘接剂内断裂，SL组的主要断裂模式是釉质内断裂(图2)。

2.1.3SEM观察 SEM结果显示SL、SE和SBU的粘接即刻及老化处理组中，一过性唾液污染即刻吹干处理后，复合树脂及牙釉质之间仍粘接紧密，未见裂隙。EO组中，一过性唾液污染即刻吹干处理后，在即刻组中的粘接界面可观察到明显的裂隙(图3)。

2.2 乳牙牙本质粘接

2.2.1剪切粘接强度 三因素方差分析结果为：粘接系统(F=32.56,P<0.001)和唾液污染(F=20.72,P<0.001)对乳牙牙本质的剪切强度均有显著影响，粘接系统与储存条件之间的相互作用差异有统计学意义(F=7.97，P<0.001)。储存条件对乳牙牙本质的剪切强度没有显著影响(F=1.60，P= 0.207，表2)。Tukey检验发现，EO组有污染的即刻剪切粘接强度(12.99±2.66) MPa显著低于其无污染的即刻剪切粘接强度(18.63±3.61) MPa，差异有统计学意义(P<0.01)。全酸蚀粘接剂SL组无污染老化后的剪切粘接强度为(14.31±1.97) MPa，有污染老化后的剪切粘接强度为(12.83±4.03) MPa，显著低于3种自酸蚀粘接系统，差异有统计学意义(P<0.01)。EO组无污染老化后剪切粘接强度为(14.41±2.68) MPa，显著低于SE无污染组的老化后剪切粘接强度(21.10±4.40) MPa和SBU无污染组的老化后剪切粘接强度(22.27±5.43) MPa，差异有统计学意义(P<0.01)。EO组有污染老化后剪切粘接强度为(10.93±2.18) MPa，显著低于SE组有污染老化后剪切粘接强度(19.56±3.64) MPa和SBU组有污染老化后剪切粘接强度(20.60±5.11) MPa，差异有统计学意义(P<0.01)。

表1 乳牙釉质剪切强度结果的三因素方差分析

I, initial; T, thermal cycling; N, non-contaminated; C, contaminated; SL, AdperTM Single Bond Plus; SE, Clearfil SE Bond; EO, AdperTM Easy One; SBU, Scotchbond Universal.

2.2.2断裂模式 对乳牙牙本质，SL和EO组的主要断裂模式是粘接剂内断裂，SE和SBU组的主要断裂模式是牙本质内断裂(图4)。

2.2.3SEM观察 SEM结果显示，SL和SE的各组中，牙本质小管内有致密的树脂突，长度超过50 μm；SBU的各组中，牙本质小管内树脂突长度超过50 μm，但密集程度较SL和SE组低。在这3种粘接剂的粘接即刻及老化处理组中，一过性唾液污染后，可观察到复合树脂及牙本质之间仍粘接紧密，未见裂隙。EO组中，牙本质小管内树脂突较细短，且稀疏；一过性唾液污染后，在即刻组中的粘接界面可观察到明显的裂隙(图5)。

A, B, resin-enamel interfaces with salivary contamination were observed by SEM after 5 000 thermal cycles in 5 ℃ and 55 ℃, representative SEM images of SL group at magnifications of ×500 and ×1 500; C, D, representative SEM images of SE group at magnifications of ×500 and ×1 500; E, F, representative SEM images of EO group at magnifications of ×500 and ×1 500; G, H, representative SEM images of SBU group at magnifications of ×500 and ×1 500. SL, AdperTM Single Bond Plus; SE, Clearfil SE Bond; EO, AdperTM Easy One; SBU, Scotchbond Universal; SEM, scanning electron microscope.

表2 乳牙牙本质剪切强度结果的三因素方差分析

I, initial; T, thermal cycling; N, non-contaminated; C, contaminated; SL, AdperTM Single Bond Plus; SE, Clearfil SE Bond; EO, AdperTM Easy One; SBU, Scotchbond Universal.

3 讨论

在研究样本建立过程中，获得釉质研究试样后进行少量打磨，主要是为了消除釉质表面污染对于实验的不良影响，同时也符合临床实际操作流程。微拉伸测试的断裂模式分为粘接剂的破坏即粘接界面断裂、牙体组织断裂、树脂内聚破坏导致的树脂断裂，以及这几种方式的混合破坏。本实验中最主要的界面断裂模式为粘接界面断裂，这提示了数据更高的可信度[18]。

根据既往研究方法，本研究采用全酸蚀粘接剂作为对照，用于评估被测试粘接剂的粘接性能[2-3]。Silverstone等[19]和Sumikawa等[20]发现釉质表面经磷酸处理后会产生Silverstone Ⅱ型样式，可提供更强的粘接力。本研究再次证实，全酸蚀粘接系统为乳牙釉质提供了更强的粘接力，并认为主要归因于35%(体积分数)磷酸(pH = 0.6)的酸度高于SE(pH = 2.0)、EO(pH = 2.4)和SBU(pH = 2.7)，可与釉质形成更大的表面微锁结力。

对于乳牙牙本质粘接，本研究发现被称作“金标准”的自酸蚀粘接剂SE和通用型粘接剂SBU(以自酸蚀模式使用)的粘接性能优于一步法自酸蚀粘接剂EO和全酸蚀粘接剂SL。大多数自酸蚀粘接剂中含有一种以上可产生化学粘接的功能性单体，SE和SBU中含有10-甲基丙烯酰氧基癸基磷酸二氢盐，EO和SBU中还含有甲基丙烯酸酯改性的聚链烯酸共聚物[2]。既往研究显示，10-甲基丙烯酰氧基癸基磷酸二氢盐能够增加自酸蚀粘接剂对乳牙牙本质的粘接耐久性[10]。本研究中EO对牙本质的粘接耐久性不够理想可能的原因有：(1)乳牙牙本质小管的直径与恒牙相近，但密度高于恒牙[21-22]，粘接时易受到牙本质小管液渗出的影响。甲基丙烯酸羟乙酯作为粘接剂中常用的一种溶剂，可以改善牙本质表面的润湿性，但高浓度的甲基丙烯酸羟乙酯会限制水分的蒸发，从而降低粘接强度[9]。EO含有较高浓度的甲基丙烯酸羟乙酯，Werle等[23]发现，延长粘接剂的吹干时间可增加EO的粘接强度。(2)在含有高浓度甲基丙烯酸羟乙酯的粘接剂固化后，牙本质小管液仍可通过渗透作用进入粘接界面，增加水潴留，使粘接界面易发生水解[24-25]。本研究发现水浴循环后EO的剪切粘接强度较SE和SBU低，这也与Pragasam等[25]的研究一致，即一步法自酸蚀粘接剂对乳牙的封闭性能不及两步法自酸蚀粘接剂。虽然SBU以自酸蚀模式使用时也为一步法操作，但其粘接性能和两步法的SE相当。

乳牙牙本质的矿物质含量低于恒牙[26]，粘接混合层也会更快发生降解[8, 21]。采用全酸蚀粘接系统时，酸蚀深度与粘接剂渗入深度不一致，导致混合层下方的胶原蛋白原纤维暴露，使这一部分更易发生降解，降低粘接耐久性[27]，因此，当临床上进行深龋治疗时，用两步法自酸蚀粘接剂SE或通用型粘接剂SBU来处理牙本质可以获得更好的粘接耐久性。结合全酸蚀粘接系统对乳牙釉质的良好粘接效果和封闭作用，可在窝洞的釉质边缘选择适当预备斜面，并使用磷酸选择性酸蚀[25]。

A, B, resin-dentin interfaces with salivary contamination were observed by SEM after 5 000 thermal cycles in 5 ℃ and 55 ℃, representative SEM images of SL group at magnifications of ×500 and ×1 500; C, D, representative SEM images of SE group at magnifications of ×500 and ×1 500; E, F, representative SEM images of EO group at magnifications of ×500 and ×1 500; G, H, representative SEM images of SBU group at magnifications of ×500 and ×1 500. SL, AdperTM Single Bond Plus; SE, Clearfil SE Bond; EO, AdperTM Easy One; SBU, Scotchbond Universal; SEM, scanning electron microscope.

低龄儿童行树脂充填治疗时，即便做到了有效隔湿，仍可出现粘接剂固化后唾液短暂污染粘接界面的情况。目前，对于这种轻度唾液污染的处理方式尚无共识。由于低龄儿童配合程度低，需要短时且有效的处理方式，本研究模拟了发生轻度唾液污染的临床情况，并测试了不同的粘接系统在使用简单的去污染方式(即刻吹干)后的剪切粘接强度，结果显示粘接剂光固化后发生轻度唾液污染，即刻吹干可以恢复SL、SE和SBU的粘接耐久性，EO的粘接性能受唾液污染的影响较大，SEM结果显示其粘接界面上出现明显的裂隙。

此外，本研究将唾液污染、粘接系统以及储存条件作为变异因素进行三因素方差分析，发现对于乳牙釉质组，粘接系统与唾液污染之间存在交互作用，说明乳牙釉质剪切强度在受粘接系统影响的同时，唾液污染也是交互影响因素；对于乳牙牙本质组，粘接系统与储存条件之间存在交互作用，说明乳牙牙本质剪切强度在受粘接系统影响的同时，样本储存条件是粘接系统作用的交互影响因素。

综上，通过本研究发现全酸蚀粘接剂对乳牙釉质粘接耐久性更佳，与EO相比，SE和SBU更适用于乳牙牙本质粘接。粘接剂光固化后发生粘接界面轻度唾液污染，采取即刻吹干的方式不会影响SE和SBU的粘接耐久性。