Biofire Filmarray下呼吸道试剂盒在危重症新型冠状病毒肺炎继发感染患者中的应用效果评价

范俊平，肖 盟，王京岚，陈 雨，张 栋，夏 鹏，柯帆航，赵 静，杨燕丽，孙雪峰，赵 颖，徐英春

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 1呼吸与危重症医学科 2检验科 3肾内科，北京 100730 4中国医学科学院 北京协和医学院临床医学八年制，北京 100730

新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)已成为肆虐全球的大流行性疾病，与2009年的H1N1流感疫情相比，此次疫情的危重症患者比率明显升高，约5%需转入ICU治疗[1]。危重症COVID-19患者，特别是转入ICU的患者易继发感染，预后较差[2-3]。对继发感染者呼吸道标本进行涂片、培养、分离和鉴定以明确病原体是治疗的关键，亦可减少不必要的抗生素尤其是广谱抗生素的使用[4]。但传统病原菌培养方法灵敏度差、耗时长，而重症患者病情变化快，对检测的时限性要求高，传统检测方法难以满足。近年来，虽然包括新一代测序技术在内的分子病原学诊断得到快速发展，但由于呼吸道本身存在定植病原体，分子技术检测过于敏感，难以准确区分定植和致病病原体。此外，分子检测手段常需外送标本，耗时亦较久，限制了其广泛应用[5]。

梅里埃诊断的Biofire Filmarray下呼吸道试剂盒(pneumonia panel,PN)是一种新开发的商业化病原学诊断技术，其将巢式多重PCR(nested multiplex PCR)与实时PCR(real-time PCR)相结合，可在同一试剂盒中执行核酸提取、扩增、检测和数据分析整个过程，并提供半定量报告。该试剂盒涵盖18种常见细菌性病原体、9种病毒和7种耐药基因(表1)，其应用已得到美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)的批准[6]。作为一种床旁检测技术(point-of-care testing,POCT)，Biofire Filmarray PN样品准备时间仅数分钟，约1 h即可出检测结果，是一种方便快捷的下呼吸道病原学检测手段。本研究旨在探讨Biofire Filmarry PN在危重症COVID-19继发感染患者病原体检测中的应用效果。

表1 Biofire Filmarray下呼吸道试剂盒检测靶标分类

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究为回顾性分析。回顾性收集并分析2020年2月至4月武汉同济医院中法新区收入ICU(北京协和医院援鄂医疗队整建制接管该ICU病房)且接受下呼吸道病原学检测的危重症COVID-19患者的临床资料。所有患者均经口咽或鼻咽拭子PCR检测确诊为COVID-19，经临床表现及影像学表现确定为重型/危重型。

本研究已通过北京协和医院伦理审查委员会审批(审批号：ZS-2326)。

1.2 研究方法

1.2.1 资料收集

通过医院信息系统收集患者基线资料、治疗和预后信息，包括性别、年龄、基础疾病、起病症状、危重症评分等。

1.2.2 标本获取和送检

患者转入ICU后，由临床医生决定采集下呼吸道病原学的指征和时机，由有经验的呼吸与危重症医学科医师使用Ambu Scope床旁支气管镜系统对患者进行支气管镜检查，选取影像有提示或有脓性分泌物的部位进行灌洗，获取支气管肺泡灌洗液后立即送检。2020年3月之前因临床微生物实验室无法使用，仅采用Biofire Filmarray PN(梅里埃诊断中国公司免费捐赠)进行检测，之后同一份标本同时送检Biofire Filmarray PN及微生物实验室进行普通培养。

1.3 数据学处理

采用Microsoft Excel 2019软件进行数据描述和整理，氧合指数、采集标本距转入ICU时间等计量资料符合正态性分布，以均数±标准差表示；年龄为偏态分布计量资料，以中位数(四分位数)表示；性别、合并疾病、临床症状所占比率等计数资料以频数(百分率)表示。

2 结果

2.1 一般临床资料

共21例符合纳入标准的危重症COVID-19患者入选本研究。其中，男性12例(57.1%)，女性9例(42.9%)；中位年龄66(53,80)岁；合并高血压10例(47.6%)，糖尿病5例(23.8%)，脑血管病4例(19.1%)，冠心病3例(14.3%)，慢性呼吸系统疾病2例(9.5%)；起病症状分别为发热18例(85.7%)，呼吸困难15例(71.4%)，咳嗽14例(66.7%)，乏力11例(52.4%)，咳痰10例(47.6%)，肌痛6例(28.6%)；入ICU时急性生理学和慢性健康状况评分Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ,APACHE Ⅱ)评分为(14.1±4.4)分，序贯器官衰竭评分(sequential organ failure assessment,SOFA)为(5.9±2.2)分，氧合指数为(129.2±79.8) mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)。

21例患者均行气管插管及机械通气，均接受广谱抗生素治疗。共送检下呼吸道标本54份，均为肺泡灌洗液，包括Biofire Filmarray PN 检测33份(61.1%)，普通培养21份(38.9%)，其中19对(38份)为“背靠背”送检Biofire Filmarray PN和普通培养。获取各标本的时间距起病时间为(44.9±15.5)d，距插管时间为(20.6±11.7)d，距转入ICU时间为(16.4±11.1)d。

2.2 下呼吸道标本培养回报结果

Biofire Filmarray PN组结果回报时间约为1 h，21例患者中共20例32份回报阳性，阳性率为97.0%(32/33)。其中30份回报病原体大于1种，回报病原体共计74例次，包括鲍曼不动杆菌复合体29例次(39.2%)，铜绿假单胞菌21例次(28.4%)，肺炎克雷伯菌16例次(21.6%)，大肠杆菌5例次(6.8%)，阴沟肠杆菌、流感嗜血杆菌及呼吸道合胞病毒各1例次(1.4%)。半定量分析显示，细菌性病原体≥107拷贝数/mL 28例次(38.4%)，106拷贝数/mL 18例次(24.7%)，105拷贝数/mL 14例次(19.2%)，104拷贝数/mL 13例次(17.8%)。耐药基因共56例次，其中 CTX-M 24例次(42.9%)、KPC 19例次(33.9%)、NDM 10例次(17.9%)、IMP 2例次(3.6%)、VIM 1例次(1.8%)(表2)。

表2 Biofire Filmarray PN组下呼吸道标本病原体回报结果半定量分析(n)

共14例患者21份标本送检普通培养，该组结果回报时间约为3 d，其中11例患者16份标本回报阳性，阳性率为76.2%(16/21)。其中3份回报病原体大于1种，检出病原体19例次，包括铜绿假单胞菌8例次(42.1%)，鲍曼不动杆菌6例次(31.6%)，嗜麦芽窄食单胞菌4例次(21.1%)，粘金黄杆菌1例次(5.3%)。半定量分析显示，“+++ ”10例次，“++”8例次，“+”1例次(表3)。

表3 普通培养组下呼吸道标本病原体回报结果半定量分析(n)

2.3 Biofire Filmarray下呼吸道试剂盒组和普通培养组结果一致性分析

因Biofire Filmarray PN组每份标本阳性结果多大于1种，故仅列出拷贝数最高的病原体及其拷贝数；普通培养组则列出鉴定的最高菌量的菌株和菌量(表4)。两组对比发现，19对(38份)“背靠背”送检标本中，Biofire Filmarray PN组和普通培养组结果吻合者为15对，一致率为78.9%(15/19)。在不一致的4对标本中，3例普通培养结果为阴性，Biofire Filmarray PN检测为阳性，另1例普通培养为嗜麦芽窄食单胞菌，该菌不在Biofire Filmarray PN的检测靶标内(检出大肠杆菌)。此外，普通培养组未分离到肺炎克雷伯菌，Biofire Filmarray PN组则回报16例肺炎克雷伯菌阳性，但拷贝数均相对较低。另Biofire Filmarray PN组检出大肠杆菌、阴沟肠杆菌、流感嗜血杆菌及呼吸道合胞病毒各1例。

表4 Biofire Filmarray PN组和普通培养组结果一致性评价

3 讨论

本研究中，21例危重症COVID-19患者共送检下呼吸道标本54份，包括Biofire Filmarray PN组检测33份(61.1%)、普通培养组21份(38.9%)，其中19对(38份)为“背靠背”送检。两种方法均有较多阳性结果回报。19对“背靠背”送检标本中，Biofire Filmarray PN组和普通培养组结果的一致率为78.9%(15/19)。

既往研究显示，流感所致危重症患者可继发其他病原体感染，继发感染亦是ICU流感患者死亡的重要原因[7-8]。COVID-19疫情暴发以来，转入ICU的患者中，13.5%～44%存在明确的继发感染[9]。其最常见的感染类型是细菌和真菌性肺炎，分离出的病原体包括泛耐药鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、产超广谱β内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBL)的铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌以及烟曲霉、黄曲霉、白色念珠菌和光滑念珠菌等真菌性病原体[10]。由于普通培养灵敏度低、耗时长，不能满足临床的需求。

Biofire Filmarray PN是一种基于分子技术的病原诊断新技术，该试剂盒已获得美国FDA批准用于辅助诊断下呼吸道感染，具有耗时短、检测速度快的优势。Gadsby等[11]研究表明，病原学诊断的快慢可影响下呼吸道感染患者的治疗决策，特别是在危重症患者中，早期病原学诊断可能有助于改善患者的预后。本研究首次在中国危重症COVID-19患者的病原学检测中使用Biofire Filmarray PN。结果显示，Biofire Filmarray PN组结果回报时间约为1 h，而普通培养组结果回报时间则约为3 d，提示Biofire Filmarray PN在检测时效性方面具有绝对优势。

本研究Biofire Filmarray PN组送检的21例患者中，20例(95.3%)回报阳性，普通培养组14例患者中，11例(78.6%)回报阳性，提示危重症COVID-19患者合并继发感染较常见。在检出病原体类别方面，Biofire Filmarray PN和普通培养均证实鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌是转入ICU的危重症COVID-19患者最常合并的下呼吸道病原体；此外，Biofire Filmarray PN亦检出了较高比率的肺炎克雷伯菌和大肠杆菌，这与既往文献[10]报道相符。在检出耐药基因方面，主要为ESBL相关的耐药基因(CTX-M)以及耐碳青霉烯肠杆菌相关耐药基因(KPC和NDM)，提示耐药菌株的存在是ICU值得持续关注的问题。

在Biofire Filmarray PN与普通培养结果一致性方面，Buchan等[6]比较了259例成年患者的肺泡灌洗液标本培养结果，Biofire Filmarray PN与普通培养法针对15种靶标病原体回报结果的阳性一致率(positive percent agreement)为96.2%，阴性一致率(negative percent agreement)为98.1%。进一步研究发现70.7%的患者有基于Biofire Filmarray PN检测结果调整抗生素的潜力，48.2%的患者可据此停用或降级抗生素，抗生素使用日平均可减少6.2 d。另一项研究评价了51例转入ICU患者的59份呼吸道吸取物或肺泡灌洗液标本回报结果，Biofire Filmarray PN检出的最常见细菌性病原体为鲍曼不动杆菌(10.2%)、肺炎克雷伯菌(16.9%)、铜绿假单胞菌(11.9%)，另有27.1%标本检出了病毒；与普通培养结果的阳性一致率为90%，阴性一致率为97.4%[12]。本研究结果显示，Biofire Filmarray PN和普通培养结果的一致率为78.9%。不一致的4对标本中，3例普通培养为阴性，Biofire Filmarray PN检测为阳性，另1例普通培养为嗜麦芽窄食单胞菌，该菌不在Biofire Filmarray PN的靶标内。另Biofire Filmarray PN检出大肠杆菌、阴沟肠杆菌、流感嗜血杆菌及呼吸道合胞病毒各1例。本研究结果提示Biofire Filmarray PN可能是检测危重症COVID-19患者继发感染病原体的理想方法。Biofire Filmarray PN和普通培养结果的一致率低于既往报道的结果，可能与样本量较小，普通培养灵敏度低等有关。

由于定性检测的限制，Biofire Filmarray PN无法明确KPC等耐药基因，而普通培养则可用抗生素敏感实验来评价耐药菌的存在。由于方法不同，目前二者无法进行直接比较。本研究分离到的病原体多数为多重耐药菌，即使未分离到耐药菌或相应耐药表型，若Biofire Filmarray PN提示耐药基因存在，仍需警惕抗生素对耐药菌的被动筛选，最终导致耐碳青霉烯类肠杆菌等耐药病原体的感染。因此，Biofire Filmarray PN的耐药基因检测一方面可起到警示作用，提醒临床医生尽可能避免或减少不必要的广谱抗生素使用；另一方面，耐药基因的存在与耐药菌株高度相关，耐药菌株的流行可能导致院内感染高发，对耐药基因的快速检测有助于监测院内感染，加快和促进院感防控措施的实施。

本研究局限性：第一，样本量较小，采用两种方法“背靠背”检测的标本仅19对，一方面无法进行针对特定病原体的比较，另一方面在一致性评价时，仅可粗略对比Biofire Filmarray PN组最高拷贝数的病原体与普通培养组的结果。第二，Biofire Filmarray PN靶标仅覆盖临床常见的下呼吸道病原体，不含真菌性病原体，可能导致检测结果无法全面反映危重症患者继发感染的病原体类型。第三，仅针对病原体回报情况进行比较，未评估检测结果对抗生素药物方案调整及患者预后的影响。COVID-19疫情期间广谱抗生素的广泛使用和CT等影像学评估手段的缺乏使得病原学检测结果的解读和使用存在明显限制。有待后续开展更多诊断学研究，进一步证实Biofire Filmarray PN检测的准确性、有效性，并评价其在患者临床结局改善中的作用。

综上，危重症COVID-19患者继发感染较常见，病原体可能以鲍曼不动杆菌复合体、铜绿假单胞菌多见。Biofire Filmarray PN可用于此类患者的下呼吸道病原学诊断，有助于临床策略的选择，但其灵敏度和准确度仍需大样本研究进一步验证。

作者贡献：范俊平、肖盟负责撰写并修改论文；徐英春、王京岚负责研究设计，修改论文；陈雨、张栋负责Biofire Filmarray PN的检测和数据整理；赵静、杨燕丽、孙雪峰、夏鹏参与标本采集、送检和临床信息整理；赵颖、柯帆航参与伦理申请和部分文稿撰写。

志谢：感谢生物梅里埃公司的无私捐赠，感谢王皓峰先生等对本研究的支持和贡献。

利益冲突：无