植物响应寄生线虫侵染机制的研究进展

邓苗苗 郭晓黎

（华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070）

植物寄生线虫（PPN）是危害农业生产的重要病害，每年遭受线虫危害的作物种植面积高达上亿亩，能造成约1 570亿美元的经济损失［1］。另外，寄生线虫的侵染还可以加重其它病原物的危害。PPN普遍都有能够穿透寄主植物组织的口针，并注入来自食道腺的分泌物，与多种植物建立长期的寄生关系。不同的适应方式和寄生行为使线虫能够在各种不同的植物中成功侵染寄生。在众多的PPN中危害较为严重的主要是属于定居型内寄生线虫的CN和RKN，其侵染性2龄幼虫可以与寄主互作分别诱导合胞体和巨型细胞的建立，取食细胞是CN和RKN的唯一营养来源［2］，对其成功寄生至关重要。虽然同属于定居型内寄生PPN，CN和RKN却存在较多的差异，RKN寄主范围极其广泛，能寄生5 500多种植物，而CN大多数种类具有寄主专化性，只寄生在特定或有限的寄主植物上［3］。另外CN和RKN在侵入部位、侵染方式、繁殖方式以及取食细胞和周围组织的形态等方面均存在差异。随着近年来对植物-线虫互作分子机制方面的深入研究，CN和RKN在寄主抗病基因、分泌的效应蛋白以及植物激素响应方面有很大的不同，本文分别对以上3个方面的最新研究进展进行综述和比较，对相关理论的潜在应用价值以及研究重点进行展望。

1 PPN触发寄主诱导的免疫反应调控机制

抗病品种的培育是线虫防治最经济有效的防控措施，植物抗线虫基因的定位和克隆是目前国内外十分活跃的研究领域，挖掘有效的抗病基因及其关联的分子标记可以加快抗性品种的培育进程。近年来，不同作物中线虫抗病基因的定位和克隆方面取得了大量进展，到目前为止克隆的抗CN基因多于抗RKN的基因，且CN抗病基因的种类更具有多样性。抗CN的基因多从甜菜、马铃薯、番茄和大豆中被克隆，如在甜菜中分离到的抗甜菜孢囊线虫（Heterodera schachtii）的基因Hs1pro-1，是第一个成功克隆的抗线虫基因，编码一个LRR-TM结构的蛋白［4］。Hs4是近期克隆到的抗甜菜孢囊线虫基因，编码菱形样蛋白酶，具有全新的抗病机制［5］；在马铃薯和番茄中克隆到了很多的抗马铃薯孢囊线虫的基因，Gpa5由位于V和IX染色体上的两个数量性状位点（QTLs）控制［6］，H3受IV和XI染色体上QTLs控制［7］，迄今为止，这两种基因的主效QTL未被克隆，但它们的定位和分子标记均已经用于育种选择。而目前克隆到的抗马铃薯孢囊线虫基因有以下3个：Gpa2对除了来自荷兰的单个种群（D383）的所有欧洲种群的马铃薯白线虫（Globodera pallida）都有抗性［8］，Gro1-4仅对马铃薯白线虫Ro1型致病力具有抗性［9］，而Hero提供针对所有马铃薯金线虫（G. rostochiensis）的广谱抗性，以及针对马铃薯白线虫的部分抗性［10］。这些基因编码典型的NBS-LRR型的抗性基因，其中除Gro1-4是TIR类R基因，其余两个都是CC类型。除此之外有研究还发现抗番茄叶霉菌的LRR结构域的胞外受体样蛋白Cf-2对马铃薯金线虫Ro1-Mierenbos的寄生也有一定的抑制效果［11］，证明植物可以利用有限数量的免疫受体来抵御不同的植物病原物。

大豆中研究较为清楚的主要是Rhg4和Rhg1两个抗大豆孢囊线虫（H. glycines）的主效基因，分别位于8号和18号染色体上［12］。线虫能够侵染带有这些抗病基因的植物根组织，但是不能形成正常的取食结构，导致线虫不能发育成熟。Rhg4序列全长约5.1 kb，编码丝氨酸羟甲基转移酶SHMT，参与丝氨酸与甘氨酸转变等一碳单位的代谢［13］。rhg1-b通过一个31 kb片段拷贝数的变化来控制植物的抗性，这个31 kb片段编码氨基酸转运子、α-SNAP蛋白（α-SNAPRhg1HC）和WI12 损伤诱导蛋白，三者共同作用提高大豆对孢囊线虫的抗性［12］。rhg1-b可以赋予PI88788类型的孢囊线虫抗性，而Peking类型的抗性需要rhg1-a及Rhg4两个基因的参与。刘世名等［14］研究发现rhg1-a的孢囊线虫抗性主要是由GmSNAP18（α-SNAPRhg1LC）介导的。α-SNAP抗大豆孢囊线虫基因在大豆中主要有GmSNAP18、GmSNAP11、GmSNAP14、GmSNAP02和GmSNAP09五个同源基因，GmSNAP18和GmSNAP11具有最高同源性。不同大豆GmSNAP成员对SCN抗性表现出重叠和功能差异，GmSNAP18和GmSNAP11都有助于增强SCN抗性但GmSNAP14和GmSNAP02不影响SCN抗性。GmSNAP18是介导不同类型大豆对SCN抗性的主效基因，而GmSNAP11为赋予SCN抗性的新型微效基因［15］。α-SNAP参与物质囊泡运输，协助NSF（N-ethylmaleimide sensitive factor）拆解SNAREs（soluble NSF attachment protein receptor）复合体以完成SNARE复合体循环使用。rhg1-b和rhg1-a抗性位点上的α-SNAPRhg1HC和α-SNAPRhg1LC在C末端具有多态性，导致与NSF互作能力减弱，影响SNARE复合体循环利用，囊泡运输受阻进而引起细胞死亡［16］。此外在Rhg1抗性大豆7号染色体上发现了一个与参考基因组不同的NSF蛋白NSFRAN07，其N-端结构域含有5个氨基酸多态性。NSFRAN07和α-SNAP多态性位于NSF /α-SNAP结 合界面，能增强与Rhg1抗性型α-SNAP的结合，减轻抗性型α-SNAP的细胞毒性［17］。另外有研究证实GmPR08-Bet VI能够促进GmSHMT08和GmSNAP18之间的分子相互作用，以协同抗线虫［18-19］。最近的研究发现α-SNAP可以与t-SNARE家族的SYP131、SYP132以及SYP31互作介导孢囊线虫抗性［20］，进一步证明囊泡运输在孢囊线虫抗性中的重要作用。上述Hs4菱形样蛋白酶和大豆抗性位点的发现表明PPN抗性基因的研究中不应只关注于NB-LRR基因，植物已经进化出了很多新的抗性机制待我们不断地发现和利用。

抗RKN的基因主要还是集中在经典的R基因。在番茄中，已经报道了10个用于抗RKN的基因，分别是Mi-1到Mi-9［21］和Mi-HT［22］。它们都来源于野生番茄，只有Mi-2、Mi-3、Mi-4、Mi-5、Mi-6、Mi-9和Mi-HT是热稳定的［23］，而且由于杂交不亲和，大多数尚未成功从野生番茄转移到栽培番茄中。在这些抗性基因中研究最为清楚的是Mi-1，该基因具有广谱抗性，能有效抵抗南方根结线虫（Meloidogyne incognita）、爪哇根结线虫（M. javanica）和花生根结线虫（M. arenaria）［24］，但对北方根结线虫（M. hapla）不具备抗性。另外Mi-1.2可以介导对蚜虫、木虱以及粉虱的抗性，是目前所知的抗谱最广的抗线虫基因。与许多R基因一样，Mi-1的功能也需要Hsp90与SGT1蛋白（suppressor of the Q2 allele of skp1）分子伴侣复合体［25］以及SlWRKY72 a和b［26］和SlWRKY70［27］转录因子的参与。此外，还有报道表明一个潜在的抗性位点Rme1在侵染的早期阶段发挥作用，但仅限于与Mi-1直接或间接相互作用发挥功能［28］，其自身在抗病过程中没有作用；樱桃李中的Ma基因是第一个从多年生木本植物中克隆的线虫抗病基因，对RKN具有广谱、耐热和高水平的抗性，该基因编码含有2 018个氨基酸残基的蛋白，是目前克隆鉴定过最长的TIR-NBS-LRR基因［29］。中国李和杏仁中的根结线虫抗病位点Rjap以及RMja可能是Ma的同源基因，桃中的RMia位点也被定位到富含TIR-NBS-LRR的基因簇上；Me1和Me3是辣椒中的显性广谱抗性基因，被定位到同一染色体上的抗病基因簇，目前被用于控制花生根结线虫、南方根结线虫和爪哇根结线虫3种主要的RKN［30］。另外除了经典的R基因参与抗RKN，还有报道发现在大豆中存在抗RKN的QTL候选基因果胶甲酯酶抑制剂［31］，但缺少进一步的功能验证。

当携带无毒基因的PPN侵染携带有相对应抗性基因的寄主时才会诱发寄主抗性引起ETI反应。目前报道的无毒基因主要有马铃薯抗性基因Gpa2识别的马铃薯白线虫分泌的SPRYSEC家族蛋白Gp-RBP1［32］、与番茄细胞外免疫受体cf-2和番茄半胱氨酸蛋白酶Rcr3pim互作的马铃薯金线虫分泌的类毒素过敏原蛋白GrVAP1蛋白［33］以及番茄抗南方根结线虫Mi-1基因的无毒基因MAP-1［34］和Cg-1［35］。

2 PPN分泌效应蛋白促进寄生

除了上述少数线虫效应蛋白能够激发植物免疫反应外，大部分的效应蛋白被鉴定为促进线虫侵染和抑制寄主免疫反应的利器。其中非常重要的一类肽类分泌蛋白能够模拟植物多肽参与调控PPN的入侵和成功寄生，但由于CN和RKN形成取食位点时存在的巨大差异，模拟肽激素也有很大不同，线虫的CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION（CLE）多肽被认为能模拟植物的CLE多肽功能调控植物细胞的分裂和分化，来协助取食细胞的建立和维持［36］。目前已经在CN和RKN中都鉴定或预测到了CLE肽，但它们的结构存在很大差异。RKN预测到的CLE肽只含有N端信号肽和C端保守的CLE结构域，可能直接将具有生物活性CLE肽传递到质外体中而无需经过翻译后的修饰加工［37］。而CN分泌的CLE肽除了N端信号肽和C端保守的CLE结构域外，还包括一个中心可变结构域［38］，N端分泌信号肽通过腺细胞分泌途径引导这些效应蛋白进入分泌囊泡，随后由中心可变结构域和CLE结构域组成的前体肽被线虫口针传递进寄主根系细胞的细胞质中［39］，经过多肽的翻译后修饰——羟脯氨酸阿拉伯糖基化和蛋白质水解加工成具有生物活性的配体转运到质外体，此时植物CLE受体激酶CLV2/CRN以及CLV1和BARELY ANY MERISTEMs可以识别线虫的CLE多肽［40］，从而正向调控合胞体的形成［41］。在CN中A-type和B-type CLE多肽都已被鉴定 到［42-43］，依据序列相似性，根结线虫也具有潜在的两种类型。C-TERMINALLY ENCODED PEPTIDE（CEP）-like［44］和INFLORESCENCE DEFICIENT IN ABSCISSION（IDA）-like肽［45］都只在RKN中发现，在CN中没有报道，植物中的CEP参与了植物根/茎、侧根和根瘤的发育，提高植物吸收硝态氮的能力，但CEP-like在线虫侵染过程中的功能是未知的，推测其可能参与调控取食位点的大小。而IDA能与受体激酶HAESA（HAE）结合激活MAPK信号级联通路诱导KNOX转录因子（分生组织发生与维持的关键基因并且参与侧生器官形态形成）表达［46］。近期报道在RKN中鉴定到了RALF-like效应蛋白，模拟植物RALF的生物活性，通过与FER的胞外受体结构域结合，促进JA信号通路关键蛋白MYC2降解等过程，破坏植物免疫系统［47］。除了模拟肽，CN还能分泌拟南芥膜联蛋白类似物，在甜菜孢囊线虫中，效应蛋白4F01通过模拟拟南芥的膜联蛋白与2OGFe（II）加氧酶家族的一个氧化还原酶结合，从而提高线虫的寄生能力，在大豆孢囊线虫中同样分离到了该类蛋白，同源性较高，可能存在相似功能［48］。另外在禾谷孢囊线虫（H. avenae）中也有报道膜联蛋白类似物Ha-annexin，它能抑制小鼠凋亡蛋白BAX激发的HR反应，并可以抑制MAPK通路上的关键基因NPK1/MKK1激发的细胞坏死［49］。除了上述在CN中发现的annexin类似物，在南方根结线虫中鉴定出了4个巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF），它们通过与植物膜联蛋白AnnAt1和 AnnAt4等相互作用抑制植物免疫力并促进线虫寄生［50］。CN和RKN中还广泛存在一类功能较为保守的分支酸变位酶CMs。研究表明CMs可能通过模拟寄主植物分支酸变位酶竞争底物分支酸，影响生长素吲哚乙酸IAA和水杨酸SA的合成，最终抑制植物免疫［51］。

除了模拟植物类似物干扰寄主生长和免疫外，PPN还能分泌其它大量的效应蛋白促进线虫入侵形成取食位点和抑制寄主的PTI及ETI反应。目前的研究报道仅有一些细胞壁降解和修饰酶，如ENGs和PELs类在CN和RKN中存在相似性，其它效应蛋白之间几乎没有重叠。在CN中参与合胞体形成的重要效应蛋白主要有参与生长素合成或运输的19C07［52］和10A07［53］，另外还有与辅助剪接体蛋白SMU2互 作的Hs30D08［54］以及Hs-Ubi1泛素 蛋白相关的效应蛋白［55］等参与合胞体的形成与维持。在RKN中MiPFN3能直接靶向破坏植物肌动蛋白微丝的聚合，影响植物肌动蛋白细胞骨架［56］。16D10靶向与植物SCL转录因子SCL6和SCL21互作［57］，7E12加速巨型细胞发育［58］；Mi8D05通过与寄主植物水通道蛋白TIP2互作，可能参与调控巨型细胞中溶质和水分的转运［59］，这些效应蛋白都能参与RKN巨型细胞的建立。

另外，PPN还利用了多种效应蛋白直接或间接抑制寄主基础抗病反应［60］。在CN中，马铃薯金线虫分泌的泛素羧端延伸蛋白GrUBCEP12［61］、SPRYSEC-19［62］、E3泛素连接酶RHA1B［63］和细胞壁松弛蛋白类蛋白EXPB2［64］；大豆孢囊线虫分泌的HgGLAND［65］、30C02［66］和10A06［67］；甜 菜 孢囊线虫分泌的HsGLAND4［68］；禾谷孢囊线虫分泌的Ha18764［69］等能通过不同的作用机制抑制寄主植物的防御反应，促进CN的侵染。而在RKN中也进化出了大量的抑制免疫的效应蛋白，如爪哇根结线虫分泌的Mj-TTL5［70］；南方根结线虫分泌的钙网蛋白Mi-CRT［71］和MiMsp40［72］；拟禾本科根结线虫（M. graminicola）分 泌 的MgGPP［73］、Mg01965［74］、MgMO237［54］和近期报道的MgMO289［75］以及北方根结线虫分泌的Mh265［76］等都能从不同的方面发挥功能，以帮助RKN寄生致病。综上CN和RKN可能都针对类似的植物过程来启动和维持取食位点建立，但它们显然有不同的分子手段，通过使用不同的效应蛋白来实现自身寄生的目的。

3 激素参与调控PPN与植物寄生过程

植物内源激素作为植物体内的微量信号分子，对植物的生长发育起着重要的调控作用。正常条件下各激素之间维持一定的平衡状态，共同调控着植物体的生长发育和新陈代谢。然而当寄主植物遭受PPN的侵染时，会影响激素稳态，这主要归结为两部分的原因：首先植物自身会响应生物胁迫启动防御系统导致内源激素变化，其次CN和RKN等在摄取植物根系取食细胞营养时会通过自身的分泌物或效应蛋白等改变植物激素的产生，最终建立有利于自身生长发育的取食位点。目前很多研究已证实水杨酸、茉莉酸和乙烯是参与植物抗病信号转导途径中的关键调控因子，而生长素和细胞分裂素则参与PPN建立取食位点。但每种激素在植物中并不是只有单一的生物学作用，而是在不同阶段、不同环境条件下存在激素的crosstalk，共同发挥功能以增强植物对环境的适应能力，特别是当植物面临病原物入侵时，会因为寄主植物和病原物种类的不同而导致植物激素产生的时间、种类与数量存有较大差异，这就需要植物精巧调控由各种激素信号转导途径偶联而成的复杂网络，灵活搭配激素组合、精密控制激素水平及信号的转导，以实现对不同病原物的有效防御［77］。

在响应植物寄生线虫PPN入侵时，植物所具备的复杂激素信号网络能够迅速反应，使植物改变代谢机制来应对逆境胁迫，此时植物体内原本用于生长发育的能量与资源会向免疫系统转移，从而达到节省能源，增强植物抵抗生物胁迫的能力。在对PPN侵染寄主后防御激素的研究中，发现通过外源施加SA预处理植物会显著增强寄主植物对CN和RKN的抗性，而目前的研究证实了JA正调控寄主植物对CN的抗性，但JA调控RKN的抗性研究却出现了不同的结果，在过去的十几年里，多篇关于JA在RKN侵染中作用的论文压倒性地支持JA作为一种防御分子正调控寄主对RKN的抗性［78］，但也有报道通过对JA信号转导或生物合成突变体和转基因植物的抗性分析产生了相反的结果。比如JA不敏感突变体jai1对RKN敏感性降低［79］；JA合成基因lox3突变体表现出抗线虫的表型；lox4突变体比野生型能发育出更多的雌虫［80］但含有更高的JA水平等。综上，猜测可能由于寄主植物突变体自身存在生长表型、产生代谢物种类、侵染RKN种类以及表型计数方法等的差异，最终导致了JA在RKN侵染后正负调控均存在的现象。另外关于赤霉素（GA）、脱落酸（ABA）、油菜素内酯（brassinosteroids）和独角金内酯（strigolactones）在线虫侵染中的作用的研究主要在水稻拟禾本科根结线虫中有报道，它们通过拮抗JA防御反应来促进PPN的侵染［81-84］。

乙烯在线虫的吸引、迁移、取食位点的形成和寄主防御中同样起着重要作用，但植物与CN和RKN的相互作用存在很多差异。乙烯虽然能正调控RKN的虫瘿重量和巨型细胞大小，但可以通过减少寄主根部对线虫的吸引力达到抗线虫侵染的效果。抗病品种比感病品种表现出更多的乙烯生物合成和响应基因的上调，也证实了乙烯能够抑制RKN的侵染［85］。相反，乙烯途径促进了CN的寄生。外源补充乙烯合成前体ACC或乙烯供体乙烯利能显著促进CN的寄生和发育，而用乙烯抑制剂处理植物能负调控线虫的发育。过量产生乙烯的突变体对甜菜孢囊线虫更加敏感，乙烯不敏感突变体则抗甜菜孢囊线虫侵染［86］。但利用大豆对大豆孢囊线虫做吸引实验时却出现了相反的结果，线虫更容易侵染被乙烯生物合成抑制剂预处理的大豆根尖，乙烯不敏感的突变体对大豆孢囊线虫的吸引力增强，乙烯过量表达的突变体对大豆孢囊线虫的吸引减弱［87］。一项对甜菜孢囊线虫侵染拟南芥的报道证实了乙烯是通过两个独立的途径来影响植物线虫相互作用的：一种是典型的乙烯信号通路，通过抑制SA触发的防御反应符合乙烯增强CN侵染的表型，另一种是独立于经典的乙烯信号通路［88］，涉及乙烯受体ETR1及其对细胞分裂素信号的调节，当ETR1活性被消除时，细胞分裂素信号转导受到显著抑制，导致寄主抗CN侵染。因此，特异寄主-线虫的相互作用、乙烯效应的时间或位置、以及与其它激素途径的交叉串扰可能造成上述乙烯参与寄主对CN侵染表型的差异。

除了上述防御激素外，生长素和细胞分裂素则参与了PPN建立成熟的取食细胞。在南方根结线虫和甜菜孢囊线虫分泌物中均已检测到生长素和细胞分裂素的存在，但尚不清楚其对取食细胞的影响。后续的研究从甜菜孢囊线虫鉴定了一个细胞分裂素合成相关的基因HsIPT1，沉默该基因显著降低线虫的毒性和取食细胞发育［89］。此外，CN和RKN为了成功寄生需要操纵寄主的激素稳态，生长素的运输和信号转导对取食位点的发育非常重要［90］，两种不同的取食细胞的形成在生长素转运蛋白PIN的利用方面存在差异。PIN1和PIN3主要参与CN合胞体的形成，而PIN2和PIN3则影响巨型细胞的建立［91］。另外细胞分裂素合成、信号转导以及代谢相关的基因表达在两种取食细胞之间存在差异，这也决定了不同的细胞周期进程。例如，细胞分裂素合成基因IPT1在甜菜孢囊线虫侵染后诱导表达，而在南方根结线虫侵染后没有IPT基因上调［92］；分解代谢基因CKX对两种线虫侵染的响应不同，CKX6在甜菜孢囊线虫和南方根结线虫侵染后均上调，而CKX5和CKX7只被甜菜孢囊线虫诱导表达。突变体分析表明拟南芥细胞分裂素组氨酸激酶受体Ahk3和Ahk4对合胞体形成很关键，而Ahk2和Ahk3是巨型细胞形成所必需的。两种PPN引起寄主不同的激素变化，形成完全不同的取食位点［89］。CN在细胞整合合胞体之前诱导有限的细胞分裂，需要细胞分裂素信号的正常激活，而RKN则诱导细胞分裂的异常增加，从而产生特有的根结［93-94］。综上，PPN通过不同的层面操纵植物，成功建立一种长期的寄生关系。

4 展望

目前的研究发现，CN和RKN与寄主植物的相互作用似乎是独立进化的，在抗病基因、效应蛋白、激素调控等方面均存在较大的差异，但它们都可以通过多种途径调控寄主的发育过程，抑制寄主的防御反应，成功寄生形成取食细胞［95］。虽然近年来植物线虫互作机制研究方面取得了快速进展，部分抗病基因也得到了成功的应用，但我们对植物与线虫互作中的复杂变化仍知之甚少。在抗病基因挖掘方面，目前克隆的抗线虫基因数量稀少，部分抗线虫基因只针对特定寄主且具有线虫小种特异性，小麦、水稻以及蔬菜中的抗线虫基因仍待克隆，针对田间毒性小种的出现亟需筛选新的线虫抗病基因资源或者开发新的广谱抗病策略。如果对抗病基因及其无毒基因之间的识别特异性有了更深的理解，将有助于我们更好的利用或者改造抗病基因。对活跃的线虫效应蛋白研究方面，目前鉴定的效应蛋白数量远远低于基于基因组预测的效应蛋白数量，对植物寄生线虫遗传操作技术的突破将极大推动线虫基因功能的研究以及线虫防控。通过效应蛋白筛选得到的部分靶标基因往往具有多种表型效应，需要借助精准基因编辑或者分子设计加以改良。此外，线虫效应蛋白或者分泌物在非寄主抗性中的作用机制对提高植物广谱持久抗性也具有重要的指导意义。