卵子冷冻液中添加合适浓度的褪黑素改善卵子存活率和受精能力的临床研究

吴成亮 苏占营 辜敏 巢时斌

[摘要] 目的 探讨在卵子冷冻液中添加合适浓度的褪黑素能否改善卵子存活率和受精能力。方法 回顾性分析2017年3月至2020年10月在本中心进行卵胞浆内单精子注射（ICSI）时临床废弃未受精卵母细胞（判断标准：受精评估时无原核和第二极体出现），根据实验目的不同，分为两个阶段。第一阶段探寻最佳的褪黑素添加浓度，经过第一阶段实验分析发现添加10-9 M浓度组卵子存活率最高（88.64% vs. 74.12%，P<0.05）;第二阶段实验是用玻璃化冷冻及解冻方法冷冻及解冻卵子后进行卵胞浆内单精子注射（ICSI），观察及分析10-9 M褪黑素添加组172枚（51.04%）和对照组（未添加褪黑素）165枚（48.96%）卵子受精能力。 结果 在冷冻液添加褪黑素后卵子冷冻复苏存活率明显改善，褪黑素浓度10-9 M为效果最佳（88.64% vs. 84.93% vs. 84.21% vs. 74.12%，P<0.05），添加10-9 M褪黑素组比未添加褪黑素组卵子正常受精率明显升高，差异有统计学意义（66.86% vs. 51.52%，P<0.01）。结论 褪黑素可以显著改善卵子冷冻复苏效果。

[关键词] 褪黑素;卵子冷冻;存活率;受精

[中图分类号] R321          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）34-0028-03

[Abstract] Objective To investigate whether adding a suitable concentration of melatonin to the oocyte freezing solution can improve the oocyte survival rate and fertilization ability. Methods A retrospective analysis was conducted on the unfertilized oocytes during intracytoplasmic sperm injection（ICSI） in our center from March 2017 to October 2020 （judgment criteria： no pronucleus and second polar body appear during fertilization assessment）. According to the different purposes of the experiment， it was divided into two stages. In the first stage， the optimal melatonin concentration was explored. After the first stage of experimental analysis， it was found that the egg survival rate of the 10-9 M concentration group was the highest （88.64% vs. 74.12%， P<0.05）. The second stage of the experiment was to freeze and thaw the eggs by vitrification and thawing， and then perform intracytoplasmic sperm injection（ICSI）. The fertilization abilities of 172 （51.04%） eggs in the 10-9 M melatonin group （with 10-9 M melatonin added） and 165 （48.96%） eggs in the control group （without melatonin added） were observed and analyzed. Results After melatonin was added to the freezing solution， the oocyte survival rate during freezing and resuscitation was significantly improved， and the melatonin concentration of 10-9 M was the optimal concentration（88.64% vs. 84.93% vs. 84.21% vs. 74.12%， P<0.05）. The normal fertilization rate of oocyte in the 10-9 M melatonin group was significantly higher than that in the control group， with the difference statistically significant （66.86% vs. 51.52%， P<0.01）. Conclusion Melatonin can significantly improve the effect of oocyte freezing and resuscitation.

[Key words] Melatonin; Oocyte freezing; Survival rate; Fertilization

人類辅助生殖技术经过40多年的发展，已经取得了巨大的进步。在生育力保存领域也取得了较好的效果，尤其是在胚胎冷冻方面，玻璃化冷冻技术的成熟应用，使胚胎冷冻复苏存活率提升到95%以上[1-2]。但是卵子冷冻技术的应用目前还不是十分的成熟，原因在于卵子的超微结构不同于胚胎，不论是传统的慢速程序化冷冻技术还是玻璃化冷冻技术，都对冷冻卵子的超微结构、卵膜的渗透性、线粒体功能等方面有不可逆的损伤[3-4]。因此导致冷冻复苏后卵子的存活率低，发育潜能差[5]。

本研究拟验证在卵子冷冻液中添加合适浓度褪黑素改善卵子冷冻复苏效果。此外，卵子冷冻技术的进步缓慢另一个重要原因是因为人类卵子稀缺和珍贵性及必须符合伦理监督原则，临床无法提供足量的样本进行深入研究。本研究采用进行单精子卵胞浆内注射技术后16～18 h受精观察时未受精卵子（未见原核形成和第二极体排出），这些卵子无任何临床使用价值，临床的处理原则是直接丢弃，但是这部分卵子能够保持一定的受精能力，具有一定的科研价值。这样既可以获得同样的研究效果又可以在符合伦理监督原则的条件下获得足量的样本，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料

选取2017年3月至2020年10月在本中心进行卵胞浆内单精子注射（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI）时临床废弃未受精卵母细胞（判断标准：受精评估时无原核和第二极体出现），本试验经医学伦理委员会审查与批准。告知患者本研究的目的，并由患者本人签署知情同意书。

1.2方法

根据实验目的不同分为两个阶段。第一阶段探寻最佳的褪黑素添加浓度，将322枚卵母细胞分为4组：对照组 85枚（26.40%），卵子冷冻液中未添加褪黑素;10-7 M组76枚（23.60%），卵子冷冻液中添加10-7 M褪黑素（默克西格玛化学品公司，美国）;10-9 M组88枚（27.33%），卵子冷冻液中添加10-9 M褪黑素;10-11 M组73枚（22.67%），卵子冷冻液中添加10-11 M褪黑素。经过第一阶段实验分析发现添加10-9 M浓度组卵子存活率最高，因此第二阶段实验目的是比较10-9 M褪黑素添加组172枚（51.04%）和对照组（未添加褪黑素）165枚（48.96%）-卵子受精能力。第一阶段实验观察指标为卵子存活率，第二阶段实验观察指标为卵子受精率。玻璃化冷冻和解冻：玻璃化冷冻方法见参考文献[6]，将卵母细胞转移至平衡液（加藤，日本）中10 min后，转移至玻璃化冷冻液（加藤，日本）中，在30 s内将卵母细胞装载到冷冻载杆（加藤，日本）并迅速投入液氮。玻璃化解冻将冷冻载杆从液氮罐中取出迅速放预温至37℃解冻液1液的Nunc四孔皿中，解剖镜下吸出所有卵子，60 s内快速解冻后将卵子转移至解冻液2中放置3 min;最后转移至解冻液3、4中各5 min。复苏后转移到G1（Vitrolife，瑞典）培养液在5%CO2、5%O2、90%N2、37℃培养箱中培养观察。

1.3统计学方法

应用SPSS 22.0统计学软件对数据进行统计学分析。计数资料以[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 卵子冷冻液中褪黑素浓度与卵子复苏存活率关系

在冷冻液添加褪黑素后卵子冷冻复苏存活率明显改善，褪黑素浓度10-9 M为效果最佳，添加10-9 M褪黑素组卵子冻存复苏后存活率与对照组（88.64% vs. 74.12%）比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 未添加褪黑素组与添加褪黑素组卵子受精率比较

添加10-9 M褪黑素组比未添加褪黑素组卵子正常受精率明显升高（66.86% vs. 51.52%），差异有统计学意义（P<0.01）。见表2。

3讨论

玻璃化冷冻法是在辅助生殖技术的基础上不断发展起来的冷冻保存技术，可将细胞或组织在短时间内快速冷冻[7-8]。玻璃化冷冻法在生殖医学领域的广泛应用，为成功冻存卵母细胞带来了曙光。尽管人类卵母细胞的低温保存技术已经得到了提高，虽然取得了较高的存活率，但仍不能常规应用于临床实践中，因卵母细胞低温保存后发育潜能受损，受精能力和胚胎发育能力都低于新鲜卵子。大量的研究表明，使用常规玻璃化冷冻方法冷冻卵子在复苏后发现卵子超微结构破坏，线粒体功能受损，卵薄膜渗透性改变。和新鲜卵子比较，冷冻卵子受精率、优质胚胎形成率及囊胚形成率低。尤其是临床妊娠率和累计活产率无法达到让临床医生和患者接受的水平[19]。

近年来，动物实验证据表明褪黑素作为一种抗氧化剂来改善低温保存动物卵母细胞的发育能力[9]。褪黑素可以有效清除氧自由基，保护卵膜通透性，保护线粒体功能，抑制卵子凋亡的机制来改善卵子冷冻结局[10-11]。活性氧（Reactive oxygen species，ROS）在冷冻复苏后卵子中积累对蛋白质、DNA、脂质和细胞膜的损伤，从而破坏卵母细胞结构和功能[12]。最近有报道称，玻璃化培养基中补充褪黑素可提高玻璃化温牛卵母细胞和小鼠卵母细胞的质量，通过减少细胞内ROS来改善其后续发育。有研究者证实褪黑素可以阻止玻璃化处理对AQP基因表达的影响。AQPs基因主要功能是控制细胞内水溶质交换的平衡[13-14]。AQP基因表达受损，影响卵膜对水的渗透性，从而形成细胞内冰晶。

研究者最近在动物实验中发现在卵子冷凍液中添加褪黑素能够有效地改善卵子冷冻复苏结局[15]。褪黑素能够通过其经典的抗氧化功能促进非灵长类物种的卵母细胞成熟及早期胚胎发育，但褪黑素对卵母细胞成熟的其他作用途径很少受到关注。褪黑素的抗氧化作用能够帮助提高细胞膜的流动性，降低细胞膜的刚性，从而促进网格蛋白介导的内吞（Clathrin-mediatedendocytosis，CME）[16]。褪黑素是一种色氨酸的衍生物，研究发现褪黑素不仅存在于松果体中，也存在于神经元细胞、皮肤和卵母细胞中，是一种有效的自由基天然抗氧化剂。先前的研究已经证明褪黑素及其代谢物作为自由基的强力直接清除者和间接抗氧化剂调节过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶超氧化物歧化酶[17-18]。其机制是褪黑素可以降低卵子因为冷冻复苏后产生的氧自由基，从而大大提升卵子冷冻复苏存活率和其后的受精及胚胎发育潜能[19]。

但是，冷冻液中添加褪黑素的浓度报道不一，尤其是在人类卵子中的应用没有可靠的数据支撑。 因此，在本研究第一阶段实验中，首先明确取得卵子存活率最佳效果褪黑素浓度。本研究设定的三个褪黑素浓度10-7 M、10-9 M、10-11 M中，10-9 M取得了最好的存活率。因此在第二阶段实验中，用褪黑素10-9 M浓度与未添加褪黑素进行复苏后卵子受精能力比较，发现添加褪黑素组卵子正常受精率得到明显改善。

本研究证实卵子冷冻液中添加10-9 M褪黑素能显著改善卵子存活率和卵子受精能力。本研究的不足之处在于因为伦理问题，采用的卵子是ICSI后未受精卵子，不能进行胚胎发育潜能的研究，样本量较小。下一步研究应该进行更大样本和多中心的临床研究。

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（收稿日期：2021-07-23）