水稻近等基因导入系芽期抗旱性鉴定及抗旱指标筛选

李其勇 朱从桦 李星月 向运佳 杨晓蓉 符慧娟 张 鸿

(四川省农业科学院植物保护研究所/农业部西南作物有害生物综合治理重点实验室,四川成都 610066)

水稻栽培对水资源需求量大,其用水量占农业用水量超过65%[1]。而干旱是世界范围内主要的自然灾害,并呈现日益加重的趋势[2],水稻生产对水分的需求与水资源短缺矛盾逐年加剧。在水稻芽期、苗期、分蘖期、拔节期、孕穗期、成熟期等各生育期受到干旱胁迫,对种子萌发、根芽生长、出苗、孕穗、光合生理、产量等有诸多不利影响[3-7],同时,不同生育阶段干旱胁迫对稻米品质影响明显[8]。为有效应对干旱威胁,开展水稻节水抗旱栽培研究变得尤为重要,而建立科学高效的抗旱鉴定方法,筛选优质抗旱育种材料育成耐旱品种,并进一步筛选具备广适性优质抗旱水稻品种,是解决干旱灾害的有效途径。

近年来,研究者针对水稻芽期、苗期、穗期、成熟期等主要生育期筛选了一批抗旱鉴定指标,包括萌发胁迫指数、苗期反复干旱成活率、抗旱系数、抗旱指数等[9-12]。在苗期、本田期进行抗旱鉴定易受环境影响,耗时长、工作量大、指标测定复杂,而芽期鉴定较为方便快捷、条件可控、短时内可进行大批量鉴定,因此针对芽期抗旱鉴定的研究较多。前人利用相关性分析、主成分分析、隶属函数综合分析等方法提出了较多的鉴定指标,如相对胚根长、相对芽长、相对芽干重、相对发芽率、储藏物质转运速率、胚芽鞘长、根系活力和β-淀粉酶活力等,但不同研究者提出的鉴定指标并不完全相同[6,9,13-15]。由于水稻抗旱性是多基因决定的数量性状,受环境影响变化复杂,导致目前抗旱性鉴定方法、指标并不统一。利用多种材料继续开展抗旱指标筛选,获得一批简单易测、适用性广、抗旱性预测效果准确的指标显得十分必要。以往的研究多采用水稻品种、品系、野生稻、杂草稻等材料[11,16-19],而采用水稻近等基因导入系进行研究的较少,水稻近等基因导入系之间仅有少量基因差异,在遗传背景相近的情况下,便于比较个别性状差异,对单一性状鉴定更为精细,避免大量遗传背景信号给性状鉴定带来干扰,有利于针对目的性状的筛选。因此本研究以近等基因导入系为材料,利用聚乙二醇6000(polyethylene glycol 6000,PEG-6000)在芽期进行种子萌发水分胁迫处理,比较近等基因导入系芽期对水分胁迫响应的差异,并通过综合评价,筛选水稻芽期抗旱性鉴定指标,同时筛选具有较强抗旱性的材料,旨在为水稻抗旱性鉴定及应用抗旱材料改良品种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以优质籼稻保持系川香29B为轮回亲本,从全球水稻分子育种计划的核心种质中选择110个材料作供体亲本,每个BC1F1选择25个以上的单株与轮回亲本回交,连续回交至BC3F1,然后自交。每个供体亲本保证有25个左右的BC3F2群体,共构建完成3 300份BC3F2材料。在抗旱性初步鉴定的基础上,选择其中5份优异川香29B近等基因导入系(Chuanxiang 29B Near Isogenic Introgression Lines,简称川香29BNIILs)为研究对象,以川香29B为对照(表1)。

表1 川香29BNIILs名称与代号Table1 Name and code of Chuanxiang 29BNIILs

1.2 试验设计

试验于2018年4月在四川省农业科学植物保护研究所恒温光照培养室进行。采用PEG-6000溶液作为干旱胁迫介质,其溶液浓度按质量体积比配制(m/v),共设置4个浓度:5%、10%、15%、20%,以蒸馏水为对照,分别用T5、T10、T15、T20、CK表示。

6份参试材料分别挑选均匀饱满种子各约1 000粒,用75%酒精表面消毒45 s后用蒸馏水润洗3次,再加蒸馏水(淹没种子)于28℃恒温培养室中浸种24 h,然后用蒸馏水润洗,置于底部铺双层滤纸、直径90 mm的培养皿内,28℃催芽。待种子露白后,取出用滤纸吸干表面水分,取萌动一致的种子均匀摆进底部铺双层滤纸、直径90 mm的培养皿中,每皿50粒,每皿分别加入10 mL相应浓度PEG-6000处理液,对照加入10 mL蒸馏水,每处理3次重复。盖上培养皿盖置于恒温光照培养室中发芽,温度28℃,光照周期8 h/16 h(光照/黑暗),光照强度200μmol·m-2·s-1。每天观察培养皿内液体的变化并酌量添加蒸馏水,保持培养皿液体恒定,共处理10 d。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 萌发指标 发芽标准为胚根突破种皮1 mm、胚芽为种子长度1/2,每日定时测定发芽种子数。根据公式计算发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数、种子萌发指数、萌发抗旱系数、根芽比、储藏物质转化率和种子萌发幼苗相对含水量:

式中,DG为逐日发芽种子数,DT为相应DG的发芽天数,计数至第8天。

式中,nd2、nd4、nd6、nd8分别为第2、第4、第6、第8天的种子萌发率,1.00、0.75、0.50、0.25分别为相应萌发天数所赋予的权重系数。

根芽性状:处理后第8天在各培养皿内随机选取20颗已发芽的种子,计量各种子的芽长、根长、根数,并分根、芽、剩余种子三部分分别称量鲜重,分装后于烘箱内105℃杀青0.5 h,80℃烘至恒重后称量干重。

1.3.2 参数计算 除萌发抗旱系数外,根据公式计算各指标抗旱系数(drought coefficient,DC),发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数、根芽比、芽长、根长、根数、芽干重、根干重、剩余种子干重、储藏物质转化率、幼苗相对含水量均以DC进行分析:

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2007进行数据整理,采用DPS14.05软件进行方差分析、相关性分析、隶属函数综合分析等。

隶属函数综合分析法是一种较好的抗旱性鉴定指标综合分析方法。采用模糊数学隶属函数法,先计算参试品种各指标的隶属值,通过标准差系数归一化处理得到各性状的权重,再以每个品种各性状隶属值与权重乘积的累加得到各品种的隶属综合值(comprehensive value ofmembership,CVM),最后依据CVM对各品种的抗旱性进行评价。

数据标准化处理公式:

式中,Xj表示第j个指标值,Xmin表示第j个指标的最小值,Xmax表示第j个指标的最大值。如某项指标与抗旱性为正相关,则采用公式(11)计算;如某项指标与抗旱性为负相关,则采用公式(12)计算。计算各品种(材料)各指标的隶属值。采用标准差系数赋予权重法计算权重系数Wj:

式中,rj表示第j个指标的变异系数。

2 结果与分析

2.1 水分胁迫对水稻种子萌发的影响

2.1.1 对水稻种子萌发相关指标的影响 由表2可知,除水分处理对发芽率抗旱系数无显著影响外,水分处理和材料对发芽势抗旱系数、发芽指数抗旱系数、活力指数抗旱系数和萌发抗旱系数的影响达到极显著水平,发芽势抗旱系数、活力指数抗旱系数受水分处理和材料互作的影响达极显著水平。对于水分处理来说,T5、T10的发芽势抗旱系数、发芽率抗旱系数、发芽指数抗旱系数、活力指数抗旱系数和萌发抗旱系数在处理间无显著差异;T15、T20的发芽势抗旱系数、发芽指数抗旱系数、活力指数抗旱系数和萌发抗旱系数均随水分胁迫加重而显著降低。表明轻度水分胁迫对水稻种子萌发影响较小,PEG-6000处理浓度大于15%时才显著抑制种子萌发,并且发芽率抗旱系数受水分胁迫影响弱于发芽势抗旱系数、发芽指数抗旱系数、活力指数抗旱系数、萌发抗旱系数。对于不同材料来说,T15、T20水分胁迫下,C2、C3的发芽势抗旱系数、发芽指数抗旱系数和萌发抗旱系数低于其他4份材料;T20水分胁迫下,6份材料的发芽率抗旱系数、发芽指数抗旱系数无显著差异。T15水分胁迫下,C3的活力指数抗旱系数最大,T20水分胁迫下,C2的活力指数抗旱系数最大。表明不同指标反映的信息并不相同。

2.1.2 对水稻种子根芽生长的影响 由表3可知,水分处理和材料均对种子萌发的芽长抗旱系数、根长抗旱系数、根数抗旱系数的影响达到显著或极显著水平,且水分处理和材料互作对根长抗旱系数影响极显著。不同水分处理下芽长抗旱系数、根数抗旱系数平均值均随水分胁迫加重而降低,且T20显著低于T5、T10。对于芽长来说,各水分胁迫下,C2、C3的芽长抗旱系数均高于其他4份材料,表明水分胁迫对C2、C3的芽长抑制效应较轻。对于根长来说,水分胁迫总体增加了种子萌发的根长抗旱系数,且T15最高。各水分胁迫下,C2的根长抗旱系数均大于1,表现出增长效应,并且随着水分胁迫加重而呈先上升后降低的趋势。T5、T10水分胁迫下,各材料的根长抗旱系数在0.88～1.38之间,抑制效应较轻;T15水分胁迫下,C2、C3、C5、C6的根长抗旱系数在1.41～1.56之间,增长效应显著高于C1、C4,且此水分胁迫对各材料的增长作用最为明显;T20水分胁迫下,C2、C5、C6的根长抗旱系数在1.22～1.42之间,显著高于C1、C3。对于根数来说,T5、T10水分胁迫下,C2、C3的根数抗旱系数较高,未受水分胁迫抑制;T15水分胁迫下,除C1的根数略高于CK外,其他材料的根数抗旱系数均受水分胁迫而降低,T20水分胁迫下,各材料的根数抗旱系数在0.75～0.94之间,根长均受水分胁迫影响而降低。

2.1.3 对水稻种子萌发物质变化指标的影响 由表4可知,水分处理和材料均对种子萌发的根干重抗旱系数、剩余种子干重抗旱系数、储藏物质转化率抗旱系数、幼苗相对含水量抗旱系数影响达显著或极显著水平,水分处理对芽干重抗旱系数影响显著。对于芽干重来说,不同水分处理下材料平均抗旱系数随着水分胁迫加重呈先升高后降低的趋势,T5、T10、T15的芽干重平均抗旱系数在1.01～1.10之间;T20水分胁迫下,各材料抗旱系数在0.79～0.95之间,材料间无显著差异。对于根干重来说,随着水分胁迫加重其平均抗旱系数也呈先升高后降低的趋势,T5、T10、T15的根干重平均抗旱系数在1.10～1.19之间;T20的根干重平均抗旱系数为0.99,但C2、C4、C5根干重抗旱系数均大于1。综上可知,轻度水分胁迫下,各材料的芽干重、根干重较对照增加,表现出促进作用;此外,水分胁迫处理对根干重的促进作用强于芽干重,重度水分胁迫下对根干重抑制作用低于芽干重,这与芽长、根长的胁迫效应变化一致。对于剩余种子干重来说,随着水分胁迫加重其平均抗旱系数增加,表明水分胁迫抑制了种子萌发的物质消耗与利用。对于储藏物质转化率来说,随着水分胁迫加重其平均抗旱系数呈显著降低趋势,T5的平均抗旱系数为1.01,表现出微弱促进效应,T10、T15、T20的平均抗旱系数在0.76～0.99之间,表明水分胁迫抑制了种子物质的转化利用,从而表现为具有较高剩余种子干重。对于根芽比来说,水分胁迫提高了种子萌发的根芽比。对于幼苗相对含水量来说,随着水分胁迫加重其平均抗旱系数逐渐降低,T5的平均抗旱系数为1.01,T10、T15、T20的平均抗旱系数在0.89～0.94,均显著低于T5。从物质变化来说,轻度水分胁迫刺激了种子萌发作用,促进了根、芽生长,重度水分胁迫抑制了种子萌发过程,降低了芽干重,降低了储藏物质的转化利用,并且减少了萌发幼苗的水分吸收积累作用,最终造成种子萌发受抑。此外,水分胁迫对芽的生长抑制效应强于根的生长,这也是种子萌发适应水分胁迫的一种方式。

表2 水分胁迫对近等基因导入系种子萌发相关指标抗旱系数的影响Table2 Effects of water stress on drought coefficient of seed germination related indexes of NIILs

表3 水分胁迫对近等基因导入系种子萌发根芽指标抗旱系数的影响Table3 Effects of water stress on drought coefficient of seed germination root and bud indexes of NIILs

2.2 水分胁迫下近等基因导入系种子萌发各指标相关性分析

由表5可知,发芽势抗旱系数与发芽指数抗旱系数、萌发抗旱系数、芽干重抗旱系数的相关系数分别为0.781、0.699、0.499。发芽指数抗旱系数与萌发抗旱系数的相关系数为0.989,呈极显著正相关,且二者与发芽势抗旱系数、活力指数抗旱系数、芽干重抗旱系数、剩余种子干重抗旱系数、储藏物质转化率抗旱系数、幼苗相对含水量抗旱系数呈显著或极显著相关。活力指数抗旱系数与发芽指数抗旱系数、根长抗旱系数、芽长抗旱系数、根干重抗旱系数、剩余种子干重抗旱系数、储藏物质转化率抗旱系数和萌发抗旱系数呈显著相关。根长抗旱系数除与活力指数抗旱系数呈极显著正相关(0.735)外,与其他指标均无显著相关性,而芽长抗旱系数与发芽率抗旱系数、活力指数抗旱系数、根数抗旱系数、根干重抗旱系数、剩余种子干重抗旱系数、储藏物质转化率抗旱系数、幼苗相对含水量抗旱系数呈显著相关,可见,相比于根长抗旱系数,芽长抗旱系数与其他指标相关性更高。剩余种子干重抗旱系数与发芽指数抗旱系数、活力指数抗旱系数、芽长抗旱系数、根数抗旱系数、储藏物质转化率、幼苗相对含水量抗旱系数和萌发抗旱系数均呈极显著负相关。储藏物质转化率抗旱系数与发芽指数抗旱系数、活力指数抗旱系数、芽长抗旱系数、根数抗旱系数、根干重抗旱系数、芽干重抗旱系数和萌发抗旱系数均呈显著或极显著正相关关系,与剩余种子干重抗旱系数呈极显著负相关(-0.850)。综上可知,与发芽势抗旱系数显著相关的指标多于发芽率抗旱系数,与芽长抗旱系数显著相关的指

标多于根长。发芽指数抗旱系数、活力指数抗旱系数、萌发抗旱系数3个指标间相关性较强,且与这3个指标显著相关的指标较为一致。储藏物质转化率抗旱系数与8个指标显著相关,且相关系数均较大。

表4 水分胁迫对近等基因导入系种子萌发物质变化指标抗旱系数的影响Table4 Effects of water stress on drought coefficient of seed germination substance change index of NIILs

表5 水分胁迫下近等基因导入系种子萌发各指标抗旱系数相关性分析Table5 Correlation analysis of drought coefficient of seed germination indexes of NIILs under water stress

2.3 水稻近等基因导入系芽期抗旱性综合评价

利用隶属函数法进行综合评价,各指标权重采用标准差系数法进行赋权,分别计算4个水分胁迫处理下6个参试材料的隶属综合值,结果见表6。C2的隶属综合值在4个水分胁迫下均排前三名,表现出较强的抗旱性,C6的隶属综合值在T5、T10、T20水分胁迫下排前三名,C3的隶属综合值在T10、T15水分胁迫下排前两名。

利用各水分胁迫下14个指标的标准差系数之和作为4个水分胁迫处理的权重计算依据,计算4个水分胁迫处理隶属综合值的权重,以各材料在4个水分胁迫处理的隶属值分别乘以各处理权重,再求和计算得出6份材料综合D值。C2、C6、C3的综合D值分别排前三名,综合评价抗旱性较强。

表6 水稻近等基因导入系隶属函数法综合评价Table6 Comprehensive evaluation of rice NIILs by membership function method

以4个水分胁迫处理下6份材料隶属综合值与D值进行相关性分析(表7),T10、T15、T20的隶属综合值与D值的相关系数分别为0.86*、0.71、0.81*,均呈正相关关系,其中T10、T20的隶属综合值与D值显著相关。同时,T20的权重最大(表6),结合相关性分析,T20对水稻近等基因系种子萌发影响效应强,指标变异度高,其隶属综合值与综合D值显著正相关。因此,以T20的指标抗旱系数与D值进行相关性分析(表8)。结果显示,综合D值与T20的发芽势、活力指数、根长、储藏物质转化率的抗旱系数显著相关,相关系数分别为-0.87、0.84、0.78、0.85。

表7 综合D值及各处理隶属综合值相关性分析Table7 Correlation analysis of comprehensive D value and comprehensive value ofmembership of each treatment

表8 综合D值与T20处理下各指标抗旱系数的相关系数Table8 Correlation coefficient between comprehensive D value and drought coefficient of eachindexes under T20 treatment

3 讨论

水稻抗旱性为数量性状,在基因作用机制上的研究表明水稻抗旱机制复杂,导致抗旱性表现复杂多变[20-23],因其复杂性在采用单一指标进行直接评价时,不同指标评价结果往往不一致,评价结果较为片面,因此抗旱性评价多采用综合评价法,主要有隶属函数法、主成分分析法、分级法、回归分析法等[16,24-26]。本研究利用隶属函数法进行综合评价,通过D值判断,C2、C6、C3材料的综合D值排前三名,抗旱性强于其余3份材料,这6份材料通过全生育期干旱试验研究表明,C2、C3的抗旱性较强[27],可见,芽期抗旱性筛选结果与全生育期抗旱筛选结果较为一致。王贺正等[25]研究表明,通过分级法综合评价芽期品种抗旱性与大田全生育期鉴定结果基本相似,这与本研究结果较一致。但另有研究指出,芽期抗旱性鉴定结果与大田产量的抗旱系数之间不存在显著相关性,芽期鉴定结果不能代表综合抗旱水平[14],这与本研究结果存在差异,可能是由于其所采用的材料偏少(仅采用3个材料)造成的。由于处理方法、测定指标、评价方法等差异,相同材料在不同时期的抗旱性评价也不完全相同。因此,在研究抗旱性时,必须在一定材料数量基础上进行综合比较,才能避免部分材料抗旱性在不同时期出现细微排序变化,而造成评价结果不同。

目前抗旱性评价并无统一方法,若各时期测定指标较多,耗时耗力,尤其是大田期对大量材料进行抗旱鉴定时,工作量十分繁重,因此,多数研究通过分析各单项指标与抗旱性关系[14,18,28],以期筛选出测定简便、通用性强的简易指标即能准确评价抗旱性。本研究通过分析T20水分胁迫下各指标抗旱系数与综合D值的相关性可知,活力指数抗旱系数、根长抗旱系数、储藏物质转化率与综合D值相关系数分别为0.84*、0.78*、0.85*,表明这3个指标与综合抗旱性高度正相关,同时指标间相关性分析显示活力指数抗旱系数、储藏物质转化率抗旱系数与其他指标相关性较高,多数达显著水平。活力指数结合了种子发芽情况及根芽生长,较全面反映了种子萌发表现,储藏物质转化率反映了种子萌发过程中物质转化利用效率,受水分胁迫的直接影响,当物质转化利用受阻,则种子发芽、根芽生长、物质形成均受抑制,因此结合相关性分析,活力指数、储藏物质转化率可作为种子芽期抗旱鉴定指标。田又升等[14]和王秋菊[15]的研究结果也显示储藏物质转运速率与抗旱性显著相关,可作为抗旱鉴定指标,与本研究结果较为一致。

由于干旱灾害频发,进一步改良水稻品种、提高水稻抗旱能力已成为抗旱栽培的重要工作[29-30]。近年来,不同研究者利用野生稻、籼粳稻杂交衍生系、旱稻突变体、不育系等不同材料开展了抗旱研究[16,31-32],并取得了相应成果。本研究采用近等基因导入系进行抗旱性研究,可进一步丰富抗旱鉴定材料,有利于发掘适宜多种材料的抗旱鉴定方法和指标。利用筛选出的抗旱性较强的材料培育优异抗旱性水稻品种,可有效将抗旱鉴定工作前移,提高抗旱育种效率。

4 结论

通过芽期模拟干旱胁迫试验,结合隶属函数综合分析及相关性分析,筛选出储藏物质转化率、活力指数与综合D值可作为抗旱性评价的指标。从抗旱性评价的科学性来说,储藏物质转化率可作为芽期模拟干旱胁迫试验中的一级鉴定指标优先使用,活力指数与综合D值可作为二级抗旱鉴定指标。由于抗旱的复杂性,鉴定方法、指标体系、评价方法等并不统一,带来了鉴定结果差异,需进一步建立统一的、标准化的抗旱鉴定体系。同时,5818(川香29B/ASOMINDORI//29B///29B)、川香29B、5819(川香29B/ASOMINORI//29B///29B)三份材料抗旱性较强,可用于抗旱育种研究。