海水净化过程中球等鞭金藻对硬壳蛤风味品质的影响

张思嘉 陈 蓉 孔周雁 徐继林

(宁波大学海洋学院,浙江 宁波 315211)

硬壳蛤[Mercenariamercenaria(Linnaeus,1758)],由于其生长快,适应温度、适盐范围广等特点[1],具有良好的经济和市场价值。硬壳蛤自2000年从美国引进以来发展迅猛,目前已形成规模化繁育养殖产业链[2]。然而,贝类多以埋栖方式生活于滩涂,主要依靠滤水活动进行摄食且移动能力差,因此贝类的食品安全及感官品质易受养殖环境影响。暂养净化作为目前解决贝类食用安全隐患最有效的解决方法,在世界各地有着广泛的应用。尤其是欧美国家针对贝类净化产业有着严格的行业规范,并对净化处理后的贝类卫生指标也有明确的完善法律或行业规定[3]。然而与欧美国家相比,我国贝类净化产业起步较晚、规模较小、技术及管理条例尚不成熟。2015年,国家科技部明确将研究养殖经济贝类净化技术列入计划指南[4-6]。如何提高贝类净化效率与效果,提高净化后贝类的安全性及感官品质将成为贝类净化产业的研究热点。迄今为止,国内外有关贝类净化技术的研究大多集中于提升净化水体的水质方面,如对净化海水进行臭氧或紫外线消毒处理[7-9]、添加二氧化氯去除水体中的微生物等。但这些净化方法对部分致病弧菌、贝类毒素的净化能力十分有限,通常需延长净化时间才能达到上市流通要求;此外臭氧、二氧化氯净化处理还会引发贝类感官品质的下降,产生不良氯味或导致臭氧味残留[10]。生物净化法作为一种安全、环保、绿色、经济的净化技术已广泛应用于污水处理,但还未见其在贝类净化产业中的相关应用。因此本研究将微藻这种易培养、环境友好、生长周期短的生物材料应用于贝类净化,以硬壳蛤为净化对象,通过添加饵料微藻(球等鞭金藻)作为净化微藻,刺激硬壳蛤进行摄食,从而促进净化硬壳蛤的滤水及排泄活动,提高硬壳蛤体内污染物及微生物的清除速率;由于饵料微藻中丰富的营养成分,如维生素、蛋白质、多不饱和脂肪酸[11],可为硬壳蛤提供优质的营养来源[12-14],因此本研究对比分析了净化前后硬壳蛤风味品质的变化,以期为解决传统净化方式净化速率慢、净化过程中贝类风味及营养成分损失等问题提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

净化试验样本:硬壳蛤由宁波瞻岐椿霖水产养殖场提供,壳长6～8 cm,平均重量为81.38 g。

判别模型训练样本:硬壳蛤购自宁波市北仑区三山农贸市场,壳长5～6 cm。

饵料微藻(球等鞭金藻)藻种由宁波大学海洋生物实验室藻种实验室提供。

1.2 主要仪器与设备

7890B-7000C气相色谱-质谱联用仪,美国安捷伦科技有限公司;GERSTELMPS robotic全自动固相微萃取进样系统,德国Gerstel公司;50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头,美国Supelco公司;VOCOL毛细管柱(60 m×0.32 mm×1.8 mm),德国CNW公司;T25高速分散机,德国IKA公司。

1.3 试验方法

1.3.1 饵料微藻培养 参考周率等[15]的微藻培养方法:球等鞭金藻采用“NML3”培养液进行培养,藻种于2.5 L锥形瓶中培养1周左右(20±2℃)用于净化试验。

1.3.2 净化试验及取样方法 试验设计见表1,将用于净化试验的硬壳蛤随机平均分为5组(对应表1中序号为3～7组),其中4组放入对应的净化塑料净化盆(长×宽×高为20 cm×15 cm×10 cm,净化前装入2 L净化海水)进行净化试验,另1组作为未经净化的对照样本。其中编号为6～7的净化盆中微藻细胞密度为1×105～1.3×105cell·mL-1。净化期间海水温度保持在22±1℃,每隔24 h整体换水1次,净化过程中始终充气。2 d后取净化盆4、6组样本分别作为灭菌海水净化2 d组和微藻净化2 d组;4 d后取净化盆5、7中组样本分别作为灭菌海水净化4 d组和微藻净化4 d组。采集后的样本按照以下方式进行处理:硬壳蛤解剖后取其软体部分(包括内脏团及性腺),用吸水纸将样本表面海水吸干,按1∶1(m∶m)加入饱和氯化钠溶液,用分散器将组织样品打至匀浆,放入-80℃超低温冰箱中备用。

1.3.3 贝类新鲜程度判别模型试验 将购于水产市场的鲜活硬壳蛤随机分为两组(对应表1中序号为1～2组),其中一组立即解剖取样,按照与净化试验样本相同的处理方式制备组织匀浆,作为模型训练集中的新鲜组。另一组装入密封袋中,置于-80℃超低温冰箱12 h使样本死亡。再将死亡后的硬壳蛤放置于22℃室温条件下48 h,直至样本腐败,产生刺鼻气味,然后制备组织匀浆,作为模型训练集中的腐败组。

1.3.4 挥发性物质检测与分析 参考蒋根栋等[16]的方法并略作修改。于15 mL顶空瓶中加入5 g预先处理的组织匀浆,再加入20μL 100μg·mL-1的2-甲基-3-庚酮(2-Methyl-3-heptanone)作为内标(溶剂为色谱级甲醇),60℃条件下震荡平衡15 min后,将预先老化30 min的固相徽萃取(solid-phase microextraction,SPME)萃取头深入到样品顶空处,60℃恒温持续振荡吸附20 min。吸附完成后,将萃取头插入到气相色谱(gas chromatography,GC)进样口,在210℃下解吸7 min。

色谱条件:采用不分流进样模式,柱温箱起始温度35℃保持2 min,以15℃·min-1升温至125℃并保持1 min,再以2℃·min-1升温至200℃保持12 min。载气为高纯氦气,流速为1.6 mL·min-1;进样口温度210℃。

质谱条件:EI离子源,电子能量70 eV;发射电流200μA,离子源温度230℃;扫描质量范围m/z 50～500。

利用NIST谱库匹配(NIST 14.0)辅助人工质谱图解析,对化合物进行定性分析。参考Hosoglu[17]的定量方法,通过计算待测挥发性物质与内标物的峰面积之比求得其当量浓度(假定各挥发性物质的绝对校正因子为1.0)。

1.4 数据处理

利用R语言中的StatTarget包,对各处理组挥发性成分按照分组变量进行单因素分析,得到各处理组间显著差异成分;同时分别按照净化时间及净化方式进行偏最小二乘多元判别分析,根据样本点在主成分得分图中的分布位置,推断各组间挥发性成分的差异性;同时根据各挥发性成分在主成分中的载荷值(loading value)以及变量投影重要性(variable importance in the project,VIP),确定各处理组的标志性化合物。

为对处理后的硬壳蛤气味轮廓进行评级,基于python语言按照以下步骤进行判别模型建立:(1)色谱数据进行缺失数据填充,标准化处理将特征值缩放到相同区间;(2)通过主成分分析降低特征的维数;(3)采用支持向量机(support vectormachine,SVM)算法,对训练样本集进行分类训练,并多次迭代得到最优参数;(4)对净化样本构成的数据集进行分类识别得到预测值(预测值反映了样本气味轮廓与训练数据集新鲜组与腐败组气味轮廓的相似度),并根据处理组预测值的分布情况,对各处理组样本的气味轮廓进行评价。

2 结果与分析

2.1 硬壳蛤主要挥发性成分

由表2可知,硬壳蛤样品共鉴定出91种挥发性成分,其中硫醚类物质5种,醇类物质14种,醛类物质8种,酮类物质12种,杂环类物质4种,烷烃类物质13种,胺类物质4种,酯类物质3种,有机酸5种。其中未净化组中,含量最高的典型风味物质为苯甲醛、蘑菇醇、1,7-辛二烯-3-醇等。在微藻净化组中,含量较高的风味物质除苯甲醛、蘑菇醇、1,7-辛二烯-3-醇外,还包括二甲基硫醚,以及几种酮类物质。海水净化组中,含量较高的风味成分为甲酸十一酯、苯甲醛、蘑菇醇、二甲基硫醚、3-辛酮、2,3-辛二酮。综上,苯甲醛、蘑菇醇、1,7-辛二烯-3-醇在所有处理组中含量较高,说明这3种物质对硬壳蛤的气味轮廓贡献度高。其中苯甲醛被认为是蒸制中华绒螯蟹性腺中的典型香气物质,具有焙烤后坚果的气味[18-19]。此外,苯甲醛在新鲜及加工鱼肉制品中也广泛存在,是水产品重要的风味物质[20-22]。蘑菇醇及1,7-辛二烯-3-醇具有蘑菇味、青草味、熟土豆味,赋予水产品特殊的植物清香和菌菇类气味[23-24]。可见,硬壳蛤风味成分数目众多,其中不饱和醇以及羰基化合物起决定性作用,这些物质与水产品品质密切相关。

表2 不同净化处理下硬壳蛤的主要挥发性成分Table2 Main volatile compounds of Mercenariamercenaria(Linnaeus)with different treatments /(ng·g-1)

表2(续)

表2(续)

2.2 净化时间与净化方式对硬壳蛤挥发性成分影响

2.2.1 净化过程中硬壳蛤挥发性成分的变化趋势为对比净化时间和净化方式对硬壳蛤气味变化的影响程度,分别以净化时间和净化方式为分组因子,通过偏最小二乘判别算法对91种挥发性化合物降维整合并形成2个主成分。通过样本在主成分得分图中的位置分布和聚类特点,比较在不同净化时间或不同净化方式下,硬壳蛤挥发性成分的差异。由图1-A可知,经不同净化方式处理的硬壳蛤挥发性成分组成差异明显,另外根据3个处理组在得分图中的相对分布位置,可以推断出第1主成分主要反映了未净化组与2个净化组的挥发性成分区别,第2主成分主要反映了海水净化组及微藻净化组挥发性成分的差异。由图1-B可知,样本按不同净化时间未产生规律性聚类。说明,不同净化方式是导致硬壳蛤样本气味差异的主要原因,而非净化时间。

图2为以净化方式为分组变量的偏最小二乘分析91种物质在主成分1、2的载荷值。其中载荷值的绝对值越大,表示该成分对某一主成分的信息贡献度越大[25]。结果表明,挥发性物质主要集中在第2主成分的正半轴,但在第1主成分方向上投影值小,说明净化方式对这些成分的作用有限。2-戊烯呋喃、苯乙醇、正己醇、紫丁香醛、甲酸己酯、甲基环庚烷在第2主成分负方向投影值大,说明这些组分在区分微藻净化与海水净化后的样本时贡献度高,且为微藻净化后样本的特征性物质。庚醛、反-2-庚烯-1-醇、苯甲醛、正己醛、2-氨基-1-丙醇、1,2,4-三甲基苯主要分布在第1主成分的负方向,且在第1主成分上投影的绝对值大,是未净化硬壳蛤的特征性物质。甲酸十一酯、二甲基硫醚、硫代乙酸甲酯、正壬醇、5-甲基-1-癸烯位于第1主成分的正方向,在区分净化样本与未净化样本贡献度高,为2种净化方式处理组的特征性挥发性成分。

2.2.2 微藻净化后硬壳蛤的显著性变化成分 为探究微藻净化对硬壳蛤挥发性成分的具体影响,参考相关文献[26-27],通过控制筛选条件[差异倍数(fold change,FC)＞2,P≤0.05],筛选出差异显著的物质共33种(图3)。其中20个挥发性组分在微藻净化后上调(具有名称标签▽点),13个挥发性组分在微藻净化后下调(具有名称标签△点)。根据筛选出差异性挥发性组分的气味描述,结合其在净化处理前后的含量变化,初步判断微藻净化对硬壳蛤气味的影响。

由表3可知,微藻净化后显著增加的物质以不饱和酮、短链醇、酯类物质为主,这些物质多具有愉悦的气味,赋予硬壳蛤海产品特殊的清甜气味[28-29]。微藻净化后显著下调的物质以芳香烃、氯化物、杂环物为主,这些物质常见于水体石油烃类有机污染,多具有刺激性的不良气味[30]。表明,微藻净化对硬壳蛤感官品质的改善具有正面效果,即提高硬壳蛤中典型小分子呈味物质含量的同时,还可促进不良气味物质的排出。

2.3 微藻与海水对硬壳蛤净化效果的评价

2.3.1 新鲜与腐败硬壳蛤的挥发性成分差异比较 为更好地评价微藻净化处理对硬壳蛤的作用,比较传统的海水净化与微藻净化的效果。本研究尝试选取新鲜与腐败的硬壳蛤样本,经过与试验组相同的处理方式测定其挥发性成分,先采用主成分分析对多维数据进行降维,再利用SVM算法中的线性核函数建立判别模型,最后利用该模型对各处理组的风味轮廓进行评估,根据评估结果确定硬壳蛤的气味品质。

由图4可知,新鲜与腐败硬壳蛤的挥发性成分差异明显(图4-A)。同时根据VIP值＞1[31]筛选出的标志物(图4-B中带有文本标签的化合物)可以推断新鲜硬壳蛤的挥发性成分种类更丰富,典型的挥发性成分包括:烯酮类,如3,5-辛二烯-2-酮被认为具有植物芳香,在贻贝、大闸蟹、南美白对虾等样品中均有较高含量[32-34];不饱和醇,如1,7-辛二烯-3-醇化合物香味阈值较高,是水产品柔和清甜香气的重要来源;羰基化合物以及杂环类物质,如2-乙基苯甲醛、茴香醚、茴香硫醚、2-乙基呋喃等物质阈值低,被认为具有坚果、香料味道和肉香[35-37]。而构成腐败硬壳蛤气味的关键性成分为含氮化合物(吲哚、2,4-二甲基-2-乙酰苯胺)和硫化物[38-39](甲硫醇、二甲基二硫、二甲基三硫)。其中吲哚是典型的腐败气味物质,硫化物则可产生辛辣的刺激性气味。类似的结果在脊尾白虾及南美白对虾等水产品也有相关报道[40-42]。

由图5可知,腐败样本色谱峰数目明显小于新鲜样本。且通过图4-B中新鲜与腐败硬壳蛤挥发性成分含量的对比可发现,腐败硬壳蛤中不饱和醛、醇、酯、短链酮类等新鲜水产品特征性挥发性组分的数量和含量均明显降低,而硫醚、吲哚的含量急剧上升。表明,羰基化合物、醇类物质的减少可能是由于动物死亡后,体内腐败微生物快速增殖,旺盛的代谢活动需要不断分解利用这些物质,同时蛋白酶、脂肪酶、氧化酶等还可降解大分子营养物质(如蛋白质、氨基酸),同时产生小分子挥发性含硫、含氮化合物[43];此外,生物体自身的酶解活动可将部分酯类、醇类氧化并生成醛和酮类物质。

2.3.2 SVM算法判别不同处理组硬壳蛤气味轮廓品质 为准确客观评价不同处理组硬壳蛤样本的风味品质,本研究以新鲜和腐败训练样本中的66种主要挥发性成分作为自变量,在python开发环境下应用SVM算法,对以上数据进行合理的综合训练并对参数进行优化得到SVM判别模型,并以此模型进行硬壳蛤气味轮廓分类预测。其中在训练数样本中分类变量新鲜、腐败分别用哑变量1、2代替。因此该模型预测值的变化范围为1至2,且若测试样本判别得分越高,则该样本的气味轮廓与新鲜样本的差异性越大,气味品质越差。首先按照与训练样本相同的色谱图积分方法,获得待预测样本中作为模型自变量的挥发性成分的峰面积,形成样本数据集。再将此样本数据集经标准化及PCA降维处理。最后代入预测模型中得到每个样本对应的预测值。

由图6可知,以模型训练集鉴定出的66种挥发性成分作为变量建立的判别模型中,海水净化对于硬壳蛤的气味轮廓的改善并不明显,海水净化组与未净化组的预测值平均水平(中位数)接近,而微藻净化组预测值平均水平(中位数)明显低于其他2组,因此微藻净化组样本的气味轮廓与训练集中的新鲜样本最接近。由此推断,微藻净化处理可以增强硬壳蛤的新鲜水产品特征性气味,经过微藻净化处理的硬壳蛤感官品质明显优于传统的海水净化。此外通过箱形图中四分位距的大小可以判别3个处理组样本气味轮廓的离散程度,即未净化组样本的四分位距最大,而微藻组样本的四分位距最小。说明直接采捕未经净化的硬壳蛤的气味轮廓差异性较大,这可能是由于养殖环境、运输胁迫对不同个体影响程度不同,从而产生生理状态的差异,造成同一批样品中,同时具有感官品质较佳和感官品质较差的个体。而在微藻净化的过程中,硬壳蛤可逐渐降低这些不利影响,使净化后的硬壳蛤品质趋于一致。

3 讨论

目前,净化技术广泛应用于水产养殖行业,净化处理是水产品上市流通前重要的环节之一。在淡水鱼养殖产业中,暂养净化可减轻淡水鱼的土腥味、泥腥味等不良风味特征,从而提高产品的适口性[44-46]。而对于海产品,净化的目的主要在于清除水产品体内的微生物、病毒、藻毒素、重金属等污染物。但也有部分研究表明,净化对改善海产品风味品质同样具有一定的效果。王丹青等[47]通过对比低盐海水暂养中华绒螯蟹中游离氨基酸和呈味核苷酸的含量时发现,经净化暂养后,中华绒螯蟹肌肉中4种鲜味氨基酸的含量均有不同程度的增加,且感官评定结果也表明,暂养净化可以提高中华绒螯蟹肌肉的鲜味和甜味;黄高凌等[48]测定花蛤净化前后的灰分、水分、粗脂肪、氨基酸、粗蛋白等营养成分时发现,净化后粗脂肪含量显著下降,谷氨酸及天冬氨酸含量略有下降,而其他各营养成分无明显差别,表明净化处理对花蛤的营养成分影响不显著,但在一定程度上对花蛤鲜味及脂肪香气有一定的影响。然而,传统净化主要依靠贝类在净化海水中的滤水活动,净化效果很大程度上取决于贝类的生理状态,如当净化时间过长,饥饿会导致滤水速率减慢,同时营养物质的消耗还可引发营养品质的下降。本研究通过添加优质饵料微藻——球等鞭金藻作为净化中贝类的营养来源,可以有效解决净化时间过长导致感官品质下降的问题。同时微藻中丰富的多不饱和脂肪酸还是贝类特征风味物质的重要前体物质,从而可提升贝类的风味品质。

本研究通过对比不同净化时间和不同净化方式下硬壳蛤挥发性成分组成,发现不同净化方式组间差异程度高于不同净化时间组,由此可以判断球等鞭金藻净化可以在较短时间内更明显地改变对硬壳蛤气味组成:如经球等鞭金藻净化后的硬壳蛤中新鲜水产品特有的香气味更加明显,主要由于具有水果以及类植物气味的不饱和酮、挥发性醇的含量增加。此外,硫化物含量的升高也可赋予贝类独特的海产风味;而部分来源于养殖环境化学污染物在净化后其含量下降,且微藻净化可以通过提高贝类的滤水及排泄速率,加快净化过程中硬壳蛤体内蓄积的不良风味物质。

球等鞭金藻具有较好贝类净化效果的原因可总结为以下几点:硬壳蛤中泥沙、污染物等不良物质的排出主要依靠滤水活动,而饵料微藻作为贝类的主要食物来源之一,在净化过程中可刺激硬壳蛤进行滤食活动,从而提高滤水量以及滤水速率加快净化效率;球等鞭金藻中含有的多不饱和脂肪酸、氨基酸,且这些物质是许多风味成分的重要前体物质[49-50];微藻中特有的风味成分也为硬壳蛤增添了水产品特有的海产品风味[51];球等鞭金藻还可作为净化过程中硬壳蛤的能量来源,在一定程度上解决了海水净化过程中由于饥饿导致的贝类活力下降、肥满度损失、营养成分流失、滋味寡淡等问题;此外,有学者提出贝类体内蓄积的有害物质如重金属、藻毒素、病毒、微生物等可以通过粪便形式排出体外,且投喂微藻可以提高这些有害物质的清除速率[52-54]。

4 结论

本研究发现,净化过程中添加球等鞭金藻对硬壳蛤风味成分的改变作用明显,其中具有类植物香味、奶香、花果香(如1-癸醇、2-壬酮、2,3-辛二酮,2-十一酮,甲酸己酯)等羰基化合物的含量增加;具有塑料味、刺激性气味的石油烃类等化学污染物的含量下降;此外,通过SVM判别模型分析可以看出,与海水净化相比,添加球等鞭金藻净化后的硬壳蛤感官品质更佳,与未净化样品的气味轮廓差异更大。本研究结果初步确定了球等鞭金藻在净化过程中对改善贝类感官品质的正面促进作用,为微藻在贝类净化产业中的应用提供了一定的理论基础。微藻净化的其他优势,如保持贝类的肥满度,提高微生物的清滤效果、加快吐沙速度等方面还需进一步研究。