高钙高蛋白日粮对肉仔鸡生长性能、血清生理生化指标和盲肠菌群的影响

王 志 ，胡仲皓，贺濛初，桂雪儿，朱 杰，冯士彬，李锦春，吴金节*

（1.安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥 230036；2.安徽省宣城市木子禽业专业合作社，安徽宣城 242000）

【研究意义】高尿酸血症（hyperuricemia）和痛风（gout）是嘌呤代谢紊乱和尿酸排泄减少所引起的一组异质性疾病[1]，饮食[2]、基因[3]或者疾病[4-5]相关的尿酸产生过多是高尿酸血症的基础。高尿酸血症和痛风诱因很多，常见的有高蛋白、高钙日粮[6]，维生素A缺乏，饮水不足，霉菌毒素中毒[7]等。【前人研究进展】骆建兵、朱小甫等[8-9]已证实，日粮中过高的蛋白质和钙会导致尿酸代谢障碍，引发鸡痛风。【本研究切入点】近年来，高通量测序技术在盲肠微生物研究中得到广泛运用，逐渐成为研究复杂盲肠菌群最为有效的手段之一[10]。【拟解决的关键问题】本试验通过在肉仔鸡日粮中添加高钙、高蛋白日粮，构建鸡高尿酸血症模型，运用高通量测序技术分析仔鸡盲肠菌群的变化，同时检测反映鸡肝肾功能的主要血清生理生化指标，观察病理组织学变化，探讨高钙高蛋白日粮对鸡生长性能、肝肾功能、血清抗氧化指标及盲肠菌群的影响，为临床上禽高尿酸血症和禽痛风的防治提供试验资料。

1 材料与方法

1.1 试验设计

取同批次体质量相近的健康1日龄的817肉仔鸡160只，随机分为4组，每组5个重复，每个重复8只鸡。4组分别为对照组（CP含量21%，Ca含量1%），高蛋白组（CP含量31%，Ca含量1%）、高钙组（CP含量21%，Ca含量5%）和高蛋白+高钙组（CP含量31%，Ca含量5%）。日粮组成及营养水平见表1。试验鸡采用地面平养，自由采食和饮水。各组鸡均按照常规饲养操作规程和免疫程序进行饲养和免疫。

1.2 样品采集和保存

在试验第21 天时各组随机取6 只鸡屠宰，收集肝、肾等组织及盲肠内容物。宰前禁饲12 h，禁饲期自由饮水。

表1 日粮组成及营养水平（风干基础）Tab.1 Composition and nutrient levels of basal diets（air-dry basis）%

1.3 测定指标

1.3.1 生长性能 每周测定各组肉仔鸡采食量、体增质量，计算的平均日采食量（g/d）、平均日增质量（g/d）和料重比（F/G）。

1.3.2 血液测定指标 分别于试验的第10 天、第21 天颈静脉采血，分离血清，-20 ℃保存。血液生化指标用迈瑞BS-220全自动生化分析仪测定，严格参照深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司提供的试剂盒使用说明检测血液中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、尿酸（UA）、尿素（UREA）、肌酐（CREA-S）活性或含量。

使用MK3型半自动酶联免疫分析仪（Thermo，美国）测定血清中超氧化物歧化酶（SOD），黄嘌呤氧化酶（XOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）、总抗氧化能力（T-AOC）的活性或含量。所有试剂盒均购自上海源叶生物科技有限公司，试验严格按照试剂盒的说明书步骤操作。

1.4 盲肠菌群高通量测序

1.4.1 DNA 提取和16S rRNA 基因扩增PCR 反应 内容物等量混合用于DNA 提取。用E.Z.N.A.®Stool DNA Kit试剂盒抽提仔鸡盲肠内容物总基因组DNA，采用引物338F（5'-ACTCCTAGGGAGGCAGG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3'）扩增细菌16S rRNA基因v3-v4区。

1.4.2 PCR 反应和高通量测序分析 采用Illumina Miseq 高通量测序技术对肉鸡盲肠微生物16S rRNA基因的v3-v4区进行了测序，获得的序列通过FLASH（v1.2.8）软件平台，根据双端序列的overlap 关系，将序列拼接成长的tag，并将序列上建库引入的barcode 和引物序列去除，然后采用Vsearch（v2.3.4）过滤嵌合体。预处理之后的cleandata使用Vsearch将序列相似性大于97%的clean tags定为一个OTU，挑选最佳的centroids（位于几何中心）序列作为该OTU 的代表序列。使用QIIME（v1.8.0）分析alpha 多样性。使用blast进行序列比对，将OTU代表序列与RDP（核糖体数据库）以及NCBI-16S数据库对每个代表性序列进行物种注释。各组样品进行菌群多样性分析和聚类分析，对样品的各个细菌门组成进行统计，得到菌群分析结果。

1.5 PICRUSt功能预测及数据处理

使用Picrust 2.0.0从16S rRNA数据中预测元基因组功能。运用STAMP软件包对元基因组进行统计分析。数据均用“平均值±标准差”表示。采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析和Duncan’s 多重比较，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 高钙高蛋白日粮对1～21日龄肉仔鸡生长性能的影响

由表2可知，仔鸡21日龄时，对照组鸡的平均体质量、日增质量、日采食量均极显著高于其他3组（P＜0.01），料重比极显著小于高钙高蛋白组（P＜0.01）；高蛋白组鸡的平均体质量、日采食量显著高于高钙组和高钙高蛋白组（P＜0.05）；高钙组鸡的平均体质量、日增质量显著高于高钙高蛋白组（P＜0.05）而料重比显著小于高钙高蛋白组（P＜0.05）。

表2 高钙、高蛋白日粮对21日龄肉仔鸡生长性能的影响Tab.2 Effects of high calcium and/or high protein diets on performance of 21-day-old broilers

2.2 高钙、高蛋白日粮对10、21日龄肉仔鸡血清生化指标的影响

由表3可知，仔鸡10日龄时，与对照组相比，高蛋白组鸡的UA、CREA-S的含量极显著升高（P＜0.01），高钙组鸡的AST 的活性显著升高（P＜0.01），高钙高蛋白组鸡的AST、CREA-S、UA、UREA 的活性或含量极显著升高（P＜0.01）；与高蛋白组相比，高钙组与高钙高蛋白组鸡的UA 含量极显著升高（P＜0.01）；与高钙组相比，高钙高蛋白组鸡的UA 含量极显著升高（P＜0.01）。仔鸡21 日龄时，与对照组相比，高蛋白组、高钙组与高钙高蛋白组鸡的AST、ALT、UA、CREA-S、UREA 的活性或含量极显著升高（P＜0.01），且高钙高蛋白组鸡的AST、ALT、UA、CREA-S的活性或含量极显著高于高蛋白组（P＜0.01）。

2.3 高钙、高蛋白日粮对仔鸡血清自由基代谢的影响

由表4可知，仔鸡10日龄时，与对照组相比，高钙组与高钙高蛋白组仔鸡血清中T-AOC 的活性显著升高（P＜0.05），蛋白组、高钙组与高钙高蛋白组仔鸡血清中MDA、XOD、SOD 含量或活性显著（P＜0.05）或极显著升高（P＜0.01），3组试验组之间无显著差异仔鸡（P＞0.05）；21日龄时，与对照组相比，蛋白组、高钙组与高钙高蛋白组仔鸡血清中MDA、XOD、SOD 含量或活性极显著升高（P＜0.01），高钙高蛋白组仔鸡血清中GSH-Px的活性极显著降低（P＜0.01）；高钙组与高钙高蛋白组仔鸡血清中SOD活性与高蛋白组相比显著升高（P＜0.05）。

表4 高钙、高蛋白日粮对肉仔鸡血清自由基代谢的影响Tab.4 Effects of high calcium and/or high protein diets on serum free radical metabolism in Broilers

2.4 高钙、高蛋白日粮对肉仔鸡盲肠菌群的影响

2.4.1 肉鸡盲肠微生物物种丰度及多样性 本研究对12 份雏鸡盲肠内容物样品进行了Illumina Miseq高通量测序，共得到有效序列587 884 条。在97%的相似水平下对序列进行OTU 的聚类，统计得到所有样品在不同OTUs中的丰度信息，共产生15 260个OTU。对于菌群而言，Alpha多样性代表每个样品中菌群的多样性，通过多种指数可以反映样品中菌群的多样性。Simpson 指数和Shannon 指数来估算样品中微生物多样性，其中Shannon值越大，说明群落多样性越高；Simpson指数越大，说明群落多样性越低。从表5 可以看出，高蛋白组的物种丰富度极显著高于对照组、高钙组、高钙高蛋白组（P＜0.01）；高钙高蛋白组的Shannon值显著低于对照组（P＜0.05），其他3组Shannon值相近；各组Simpson无显著差异。

表5 雏鸡盲肠微生物物种丰富度及α_多样性指数的比较Tab.5 Comparison of intestinal microbial species richness and alpha diversity index of broilers

2.4.2 不同状态下盲肠微生物菌群组成分析 利用软件Vsearch 对12 个样品测得的序列在大于97%相似性条件下进行聚类，挑选最佳的centroids（位于几何中心）序列作为该OTU 的代表序列，用于后续物种分类注释。共将测得的雏鸡盲肠内容物中所有菌群分为7 个菌门，厚壁菌门Firmicutes、拟杆菌门Bacte⁃roidetes、变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteria、软壁菌门Tenericutes、蓝细菌门Cyanobacteria、黏胶球形菌门Lentisphaerae。各组的优势菌门分别是变形菌黏胶球形菌门门、拟杆菌门和厚壁菌门，这3 个菌门的相对丰度占分别总序列的98.37%～99.73%。在对照组、高蛋白组、高钙组、高钙高蛋白组中，厚壁菌门分别占总序列的平均值为60.8%、51.7%、52.39%和48.42%；拟杆菌门分别占总序列的平均值为37.58%、45.79%、43.69%和42.74%；变形菌门分别占总序列的平均值为1.28%、2.13%、2.95%和8.55%；在属水平上，优势菌属为厌氧杆菌属，在对照组、高蛋白组、高钙组、高钙高蛋白组中，分别占总序列的平均值为28.12%、14.16%、14.13%和1.36%；其次是粪便杆菌和疣微菌属，分别占总序列的平均值为13.50%、6.74%、1.92%和3.61%和6.18%、5.8%、12.03%和9.11%。

2.4.3 不同状态下盲肠微生物差异菌群比较 分析比较各组OTU 值大于0.02%时的菌门所占比例的变化（表6）。发现在门水平上，与对照组相比，高蛋白组、高钙高蛋白组的厚壁菌门所占总序列的比例显著减少（P＜0.05）；高钙、高钙高蛋白组的变形菌门所占总序列的比例显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）增加;而相比于高蛋白组，高钙高蛋白组的变形菌门所占总序列的比例显著（P＜0.05）增加。在属水平上，与对照组相比，高蛋白组的厌氧杆菌属、粪便杆菌属、梭状芽孢杆菌属第十八类群、嗜碱菌所占总序列的比例显著（P＜0.05）或极显著减少（P＜0.01），而另枝菌属、颤杆菌克属所占总序列的比例显著（P＜0.05）或极显著增加（P＜0.01）；高钙组的梭状芽孢杆菌属第十八类群所占总序列的比例显著减少（P＜0.05），而卟啉单胞菌属、梭状芽孢杆菌所占总序列的比例显著增加（P＜0.05）；高钙高蛋白组梭状芽孢杆菌属第十八类群、厌氧杆菌属、粪便杆菌属所占总序列的比例显著（P＜0.05）或极显著减少（P＜0.01），而另枝菌属、理研菌属、卟啉单胞菌属所占总序列的比例显著（P＜0.05）或显著增加（P＜0.01）；相比高蛋白组与高钙组，高钙高蛋白组的厌氧杆菌属所占总序列的比例极显著（P＜0.01）降低，且高蛋白组的卟啉单胞菌属所占总序列相比高钙高蛋白组显著降低（P＜0.05）。

表6 在门与属水平上各组显著差异的序列Tab.6 Sequences of significant differences among groups at Phylum and Genus levels

2.4.4 菌群代谢功能预测 PICRUSt是通过微生物群落的丰富度与数据库比，从而在不可观测的情况下推测出生物群落的功能信息[9]。本试验基于Greengenes 16S rRNA 数据库结果获得442 个预测的功能。运用STAMP软件对数量前20的功能进行分析，结果显示：与对照组相比，糖酵解Ⅱ、戊糖磷酸途径（非氧化值分支）、卡尔文-本森-巴沙姆循环、戊糖磷酸途径等的功能基因在高蛋白组偏低，中乙酰基循环Ⅱ在高蛋白组中偏高；戊糖磷酸途径、戊糖磷酸途径（非氧化值分支）等的功能基因在高钙组中偏低，腺苷脱氧核糖核苷酸从头合成Ⅱ、腺苷核苷酸从头合成超途径I、鸟苷脱氧核糖核苷酸从头合成Ⅱ、腺苷脱氧核糖核苷酸从头合成Ⅱ、TCA 循环I 等的功能基因在高钙组中偏高，鸟苷核苷酸从头合成超途径Ⅱ、L-异亮氨酸从头合成超途径I、糖酵解Ⅲ等的功能基因在高钙高蛋白组中偏低，L-异亮氨酸从头合成超途径I、鸟苷核苷酸从头合成超途径I、腺苷核苷酸从头合成超途径I、腺苷核苷酸从头合成超途径Ⅱ、乙酰基循环Ⅱ、嘧啶核苷从头合成的超路径等的功能基因在高钙高蛋白组中偏高；与高蛋白组相比，肌苷5，-磷酸降解等的功能基因在高钙组中偏高；L-异亮氨酸生物合成的超途径I、糖酵解Ⅱ（来自6-磷酸果糖）、腺苷核苷酸从头合成超途径I、腺苷核苷酸从头合成超途径Ⅱ、鸟苷核苷酸从头合成超途径Ⅱ、赖氨酸生物合成Ⅲ、赖氨酸生物合成Ⅳ等的功能基因在高钙高蛋白组中偏高，嘧啶核苷从头合成途径、糖酵解Ⅲ、鸟苷核苷酸从头合成超途径I 等的功能基因在高钙高蛋白组中偏低；与高钙组相比，L-异亮氨酸生物合成的超途径I、糖酵解Ⅱ（来自6-磷酸果糖）、肌苷5’-磷酸降解、腺苷核苷酸从头合成超途径Ⅱ、鸟苷核苷酸从头合成超途径Ⅱ、L-精氨酸的生物合成（乙酰基循环）等的功能基因在高钙高蛋白组中偏低；腺苷核苷酸从头合成超途径I、鸟苷核苷酸从头合成超途径I 等的功能基因在高钙高蛋白组中偏高结果如图1 所示。

图1 预测功能基因在对照组和实验组之间的差异（二级功能层）Fig.1 The variation of predicted functional profiles between control and experimental groups（hierarchy level 2）

2.5 试验鸡肝脏、肾脏的HE染色结果

显微镜观察发现，对照组组仔鸡的肝脏（图2A）和肾脏（图2E）组织正常；高蛋白组仔鸡的肝脏组织有炎性细胞浸润及空泡变性（图2B），肾脏组织肾小球萎缩（图2F）；高钙组组仔鸡的肝脏组织坏死及空泡变性（图2C），肾脏组织肾小球萎缩、炎性细胞浸润（图2G）。高钙高蛋白组肝脏组织肝细胞崩解、坏死、肝细胞空泡化程度加深（图2D）；肾小球萎缩，肾小管上皮细胞空泡化、肾小管上皮脱离基底膜、崩解（图2H）。

图2 肉鸡肝脏和肾脏HE染色后的显微照片（放大倍数：100）Fig.2 Microscopic pictures of broiler liver and kidney after HE staining（Magnification：100）

3 讨论与结论

3.1 高钙高蛋白日粮对仔鸡生长性能的影响

试验期间，对照组仔鸡日均采食量正常，体质量平稳上升，其精神状态、行为状态良好。高蛋白组采食量减少。高钙组仔鸡日均采食量较为平稳，排泄白色稀便，站立困难。高钙高蛋白日粮组仔鸡采食量严重下降，生长性能严重降低，基本处于生长停滞阶段，仔鸡精神萎靡，站立困难，拉白色稀粪。而且高钙组及高钙高蛋白组对仔鸡生长性能的不良影响高于高蛋白组。

3.2 高钙高蛋白日粮对仔鸡血清自由基代谢的影响

高钙高蛋白日粮能引发痛风[11]，本试验对饲喂高钙高蛋白日粮鸡血液部分生化指标的影响进行了动态观察，旨在探讨和禽痛风密切相关的肝肾功能异常在尿酸代谢中的作用。

仔鸡10 日龄时，高钙组与高钙高蛋白组血清AST 的活性显著提高表明这两组的鸡肝脏代谢异常，3 组实验组血清UA、CREA-S 的含量显著升高表明高钙、高蛋白日粮的加入可导致肾脏尿酸排泄障碍，造成肾脏损伤，甚至引起高尿酸血症[12]；仔鸡21 日龄时，高钙组与高钙高蛋白组血清AST 及ALT 的活性显著提高表明这两组的鸡肝脏受到的损害加剧，而3组试验组血清UA、CREA-S 的含量显著升高表明高钙、高蛋白日粮持续损害着鸡的肾脏，造成肾损伤加重，引发3组试验组的鸡的高尿酸血症。

3.3 高钙高蛋白日粮对仔鸡血清自由基的影响

机体的氧化与抗氧化处于一种动态平衡，但在患病或衰老等状态下，会出现由于自由基水平升高而导致的病理现象[13]。在试验的第10 天，高蛋白组血清中MDA 含量显著升高，反映氧自由基对细胞造成了一定程度的损伤[14]；高钙组与高蛋白组血清中的MDA 含量和XOD 的活性显著提高表明此阶段催化产生大量氧自由基，生成更多的尿酸和氧自由基[15]，从而引起组织的损伤，而血清SOD 活性的提高这可能是机体抗氧化系统对高尿酸血症的代偿性反应[16]。在试验的第21天，试验组鸡血清MDA含量与XOD的活性显著提高及GSH-Px活性的显著降低表明氧自由基对细胞造成了持续性的损害。

3.4 高钙、高蛋白日粮对仔鸡盲肠菌群结构的影响

本研究应用IlluminaMiseq高通量测序分析了饲喂高钙、高蛋白日粮对21日龄仔鸡盲肠菌群的影响。通过物种注释可以看出，含量排在前五的门分别是厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、蓝细菌门、放线菌门，这一结果与Shaufi 等人[17]的研究结果相似。本研究表明，厚壁菌门是健康鸡的盲肠中含量最多的菌群。据报道，厚壁菌门与粗饲料的消化有关，鸡作为以植物为主要食物禽类，厚壁菌门对其营养消化吸收有帮助作用，而变形菌门的增加常发生在胃盲肠炎症的宿主[18]。在本试验中，高钙组及高钙高蛋白组的厚壁菌门均显著减少，变形菌门均显著增加说明高钙及高钙高蛋白日粮影响了鸡对营养物质的吸收，可能引起了鸡的盲肠炎症。而本研究中也发现盲肠中微生物的优势有益菌群发生改变，如厌氧杆菌属和粪便杆菌属；PICRUSt 功能预测结果显示对照组与试验组鸡的盲肠菌群功能组成差异显著，且高蛋白组和高钙组鸡的盲肠菌群功能组成与高钙高蛋白组之间差异显著。表明高钙、高蛋白日粮破坏了仔鸡盲肠菌群的结构，使得葡萄糖代谢和一些氨基酸和核苷酸的合成代谢出现紊乱，且饲喂高钙高蛋白日粮对鸡盲肠菌群的不良影响大于饲喂高蛋白日粮和高钙日粮。

3.5 高钙、高蛋白日粮对仔鸡肝、肾组织病理变化的影响

肝脏是尿酸的生成器官，而肾脏是尿酸的排泄器官[19]，当这些器官受到损伤时，就会导致尿酸代谢障碍[20]。本试验中，各试验组日粮均导致仔鸡肝肾不同程度的损伤，表明高蛋白、高钙、高钙高蛋白日粮对肝肾组织均有损害作用。

本研究表明，高钙高蛋白日粮导致仔鸡生长性能、抗氧化能力降低，肝肾功能受损，引起仔鸡高尿酸血症及盲肠菌群紊乱。