从SARS、MERS到COVID-19爆发谈高级别生物安全实验室及其应用

张国林，景荣先，邢以文，薛 满

（1.苏州市药品检验检测研究中心，江苏苏州 215000；2.苏州市立医院，江苏苏州 215000；3.南京中医药大学，南京 210000）

0 引言

生物安全是国家安全的重要组成部分，与国家核心利益密切相关［1-2］。我国已经将生物安全纳入国家安全战略，生物安全法草案已于2019年10月21日提请十三届全国人大常委会第十四次会议审议。随着科学技术的发展，人们对生物安全的认识不断深化，同时也推动了生物安全实验室的不断发展。根据病原微生物的传染性和危害性大小，国际上通常将生物安全实验室分为BSL-1、BSL-2、BSL-3 和BSL-4 4 个等级。高级别生物安全实验室是指生物安全3级（BSL-3／ABSL-3）和4 级（BSL-4／ABSL-4）实验室，主要用于操作风险等级较高的烈性病原微生物。

随着全球生物安全问题的日益突出，尤其是烈性传染病所带来的生物安全问题频发，生物安全及生物安全实验室建设已引起各国的普遍重视。世界范围内新的烈性病原体和新发高传染性病原体不断出现，如严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、埃博拉病毒（Ebola virus）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERSCoV）、2019 新型冠状病毒（2019-nCoV）等。为防止传染病病原体的扩散，病原体的研究必须在相应等级的生物安全实验室中进行。我国已制定了一系列法规和标准，规范高等级生物安全实验室的建设、硬件配套、设施条件、生物防护等［3］。通过国际合作和自主创新，我国高级别生物安全实验室建设已经起步并积累了一定的经验，且通过接触国际实验室加深了对生物安全实验室的认识。从SARS、MERS到新型冠状病毒肺性炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）的每一次公共生物安全事件都强化了人们对生物安全问题的认识，也促进生物安全管理体系和防护措施的完善。现就高级别生物安全实验室及其在COVID-19流行背景下的应用进行论述，为相关领域的研究及疾病的诊断和治疗提供参考。

1 高等级生物安全实验室的功能与建设的必要性

烈性传染病预防、控制和新药开发需要高级别生物安全实验室作为技术平台。2003年中国爆发的SARS疫情、2014年西非国家爆发的埃博拉疫情、2019年中国爆发的COVID-19疫情给人类生命安全带来严重的威胁。虽然目前我国疫情已得到有效的控制，但仍存在再次爆发的可能性，而国外疫情正呈现加剧的态势。同时，未来社会也存在爆发未知烈性传染病原体导致传染性疾病流行的可能性。因此，需对病原微生物进行系统而深入的研究，而此过程需要在高级别生物安全实验室内进行。世界卫生组织提出埃博拉病毒、克里米亚刚果出血热病毒、中东呼吸综合征病毒以及马尔堡病毒等需要在BSL-4级生物安全实验室内进行。同时，为降低潜在的生物安全风险，检测潜在的含有COVID-19病毒的样本也应在高级别生物安全实验室内进行。

基于安全角度的考虑，开发2019-nCoV等高致病性微生物疫苗和相关的治疗性药物研究需在高级别生物安全实验室内进行。SARS、MERS、COVID-19等高致病性微生物诱发疫情的突然爆发给全球人类的生命安全和经济带来极大的威胁。研制开发应对高致病性微生物的疫苗和药物是进行预防及治疗的关键。开发有效的疫苗是控制COVID-19的大流行、消除其传播和复发的重要措施［4-5］。目前抗病毒类疫苗包括减毒活疫苗、非活性疫苗、类病毒颗粒疫苗、蛋白基疫苗、病毒载体疫苗、基于DNA或mRNA的疫苗等。开发高致病性微生物疫苗和治疗药物均涉及病毒株的分离、筛选和培养等高风险的操作过程，这类研究操作必须在高等级生物安全实验室中进行。

国防生物安全的预警与处置需高等级生物安全实验室。生物安全是国防安全的重要组成部分，有害生物制剂潜在威胁在一定程度上也是国防安全的重要威胁。国防安全中应能够对生物安全应有效应对，对可能的生物安全威胁做到有效预警、处置。历史上曾有过多次生物恐怖相关的报道，如1984年美军潜艇肉毒毒素中毒事件、1995年日本奥姆真理教导演的生物恐怖等。2001年美国发生的为期数周的炭疽事件造成5人死亡，17人感染的生物恐怖事件。因此，除了建立和完善管理体制和应急反应机制、建立生物危害预警和评估系统外，建立高等级的生物安全实验室也是十分必要的。高级别的生物安全实验室是开展有害生物制剂及生物恐怖制剂监控、研究的重要平台［6］。

极端环境中病毒研究。随着人类探索范围的扩大及全球气候环境的变化，极端环境中，如高寒极地、深层冻土中的病毒不断出现，如14万年前的番茄病毒、3万年前的新型巨型DNA活病毒、7000年前的石藻病毒等。虽然目前对这些病毒的风险及危害性尚未得到完全的评估，但极端环境中病毒给人类社会的健康带来极大的风险是确定的。极端环境中病毒等微生物的研究需要在严格防护的环境中进行，而高等级的生物安全实验室无疑是第一选择。

2 生物安全实验室的法规与特点

2.1 生物安全实验室的相关法规

目前，生物安全法草案已提请十三届全国人大常委会第十四次会议审议。在此之前，我国相关部门已制定了一些法规和国家标准来规范生物安全实验室的建设、运行和管理。《中华人民共和国传染病防治法》对与病原微生物有关的疾病预防控制机构、医疗机构的实验室和从事病原微生物实验的单位的生物安全管理做了规定。2004年国务院颁发《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务院424号令）作为生物安全实验室建设运行的指导文件。卫生行业标准《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》参考了美国《微生物和生物医学实验室的生物安全》相关内容，涵盖了生物安全防护的基本原则、实验室的分类、生物安全实验室的基本要求、生物危险标示的使用、三级和四级生物安全实验室的使用和维护等内容。中华人民共和国住建部制定的GB50346-2011《生物安全实验室建筑技术规范》对生物安全实验室的分级和技术指标、建筑和装修、暖通空调、给水排水和气体空供应、消防和安全等内容作了具体的规定。国家标准GB19489-2008已成为全国范围内实验室规范化管理的指南和准绳。与国外同类标准相比，GB19489-2008《实验室生物安全通用要求》和GB50346-2011《生物安全实验室建筑技术规范》等是趋于严格的。另外，生物安全管理相关的法规标准还包括《人间传染的病原微生物名录》（2006年）、《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》等。

虽然上述法规和标准均强调了生物安全管理体系的完整性，但这些标准均为多年以前制定，制定日期最晚的GB50346—2011《生物安全实验室建筑技术规范》执行时间也已接近10年，GB19489—2008《实验室生物安全通用要求》更是超过10年，这些标准均存在对高级别生物安全实验室特征性管理要素描述及要求不足的局限性［7］。以下7条为现行标准中存在的局限性的列举：①潜在污染风险的周期性评估方面。高等级生物安全实验室设施、设备等硬件很好地控制了病原微生物泄露的风险，且该类实验室的个人防护设备避免了工作人员感染高致病性生物因子的可能性。合格的科研和实验人员经过严格的岗位知识和操作技能培训考核降低了生物安全事件的发生概率。但高级别生物安全实验室设施设备运行过程中是否会出现短时间的无监控异常期、按照实验室制定的操作规程进行的标准操作是否会出现与预期结果不一致的情况等问题仍需要进行风险评估。对高等级生物安全实验室进行潜在污染风险的周期性评估、及时发现生物安全隐患并采取应对措施是避免生物安全事件发生的重要举措。现行版的GB19489—2008条款未强制要求高级别生物安全实验室执行潜在污染风险的周期性评估。②病原因子失活验证试验方面。高级别生物安全实验室的样本、废弃物等在转移到生物安全二级及以下实验室前，应对开展操作的生物因子进行风险评估，确定进行失活验证试验的必要性。若经风险评估后试验材料需要进行灭活实验，应选择合适的灭活方法处理。经失活验证确认生物因子完全失活后试验材料才可移出高级别生物安全实验室。GB19489—2008条款未强制要求高级别生物安全实验室制定并严格执行失活试验试验的规程及操作。③严格物理封闭结合微生物封闭措施。采用物理封闭措施、生物封闭措施等多维的封闭性措施是高级别生物安全实验室运行安全的重要方面。物理封闭措施为高等级生物安全实验室建筑的物理结构隔离和实验人员的防护措施，生物封闭措施主要是基于生物学手段，如采用功能缺陷性病原体、低致病性或无致病性微生物类型等降低生物危害风险的措施。现行版的GB19489—2008中关于“高级别生物安全实验室宜尽可能地采用微生物的封闭措施开展实验活动”非强制性的条款。生物封闭措施应该作为高级别生物安全实验室安全控制的关键环节和重要特征，应将生物封闭措施列为强制性条款。④高等级生物安全实验室的分子诊断实验区应采用无生物风险阳性对照。经提取的病毒核酸可作为科学研究和实践操作中的阳性对照，但其只能作为核酸提取后各操作步骤的对照，无法对前处理步骤及核酸提取过程进行对照。对高致病性病毒来说，用披甲核酸代替灭活的高致病性病毒作为阳性对照为最佳的解决方案。⑤ 增强高等级生物安全实验室的生物安全文化氛围。高等级生物安全实验室的物理屏障和人员防护能够很好地隔离高致病性病原生物因子，而操作人员的疏忽是高级别生物安全实验室发生获得性感染的重要原因。美国疾病控制和预防中心（CDC）宣布的3起重大生物安全事件均与工作人员的失误有关，包括炭疽杆菌孢子处理不当使数十名员工处于暴露于炭疽的风险；低致病性流感病毒与高致病性菌毒株交叉污染；包括6瓶天花病毒的数百个生物制剂样本存放在冷藏室数十年而无人注意［8］。因此，尤其是在高级别生物安全实验室中，必须将管理程序与生物安全文化放到同等重要的位置。将现行版的GB19489—2008中“高级别生物安全实验室应建立生物安全文化”修订为强制性条款是合适的。⑥严控高等级生物安全实验室防火措施。虽然消防评估表明高级别生物安全实验室的火灾风险不高，但仍需严格控制。GB19489—2008的第7.22.3条可修订为“化学品储存间的储存量不应超过该化学品24 h的消耗量”（参考GB50472 第11.2.1.1 条），规定实验室可燃气体和液体存放量的限值或范围。同时应对GB50346—2011“三级和四级生物安全实验室防护区设置机械排烟系统”进行风险评估。对不设置机械排烟系统的高等级生物安全实验室补充其他防火措施，如空气采样早期烟雾预警系统、核心区域内设置一氧化碳浓度探测和声光报警措施等。另外，通风系统应采用经消防部门认可的生物型密闭阀代替防火阀的防火措施［9］。⑦ 制定废水处理系统和动物残体处理系统技术标准。单独借助蒸汽灭菌器及动物屠宰处理设备的相关标准对高级别生物安全实验室并不完全合适。以上仅为现行关于高等级生物安全实验室的部分局限性，随着技术的进步和人们对生物风险认知加深，应对现行生物安全相关法律、法规和技术标准进行修订完善，从建设理念、风险管理、文化氛围、新技术应用等方面确保高等级生物安全实验室的安全性。

2.2 高等级生物安全实验室的特点

生物安全实验室发展至今已经历了4个时期，即初步认识的萌芽期（1826—1949年）、生物安全实验室分级管理的形成期（1949—1983年）、生物安全实验室仪器设施和管理体系系统化、规范化的成熟期（1984—2004年）和2004年至今的繁荣期。高等级生物安全实验室是烈性传染性疾病预防控制、科学研究和诊断治疗、疫苗及药物研发的重要技术平台。但生物安全实验室，尤其是高等级生物安全实验室在建筑建设、区域划分等方面存在一些特殊的要求。高级生物安全实验室若与其他实验室共用建筑物，应在独立隔离的区域内设置，或直接将高级别生物安全实验室建设在独立的建筑物内。高级别生物安全实验室区域通常划分为防护工作区和辅助工作区。生物安全三级实验室防护工作区通常包括主实验室操作区、缓冲区、防护服更换区等。生物安全四级实验室防护区除了包括上述区域外，还包括化学淋浴间、防护走廊等，这些都是存在较高生物安全风险的区域。辅助工作区通常不存在生物安全风险。高级别生物安全实验室内未经处理的空气在任何情况下都严禁外排，且要求防护区内房间维持负压、有序的压力梯度和定向气流。生物安全领域面临的严峻形势促进了生物安全的相关研究，其中传染病病原体的检测、疫苗及治疗药物的研发等均需要高等级的生物安全实验室。

从SARS、MERS到COVID-19的每一次公共生物安全事件都强化了人们对生物安全危害的认识，也促进生物安全管理体系和防护措施的完善。我国2003年前约有10个BSL-3级的高等级生物安全实验室，但当时的高等级生物安全实验室功能相对较弱，相关的法律法规也存在较大的局限性。SARS疫情后，国家对生物安全实验室的建设与管理越来越规范，国务院于2004年发布了《国家高等级生物安全实验室建设规划》。国内多家机构新建或改扩建了生物安全实验室。目前，我国大陆地区已建成2家生物安全四级实验室，即中科院武汉病毒所的BSL-4生物安全实验室和中国农科院哈尔滨兽医研究所的ABSL-4生物安全实验室。目前，越来越多的生物安全实验室被不断建立，其运行发展呈现出一定的特点：高级别的生物安全实验室的建设均纳入国家生物安全体系的建设范畴；大部分高等级生物安全实验室属于政府部门，日常运行依靠国家财政投入，小部分为私营机构管理运行；逐步建立了以高等级生物安全实验室为核心的生物安全体系；生物安全实验室的功能与职能不断发生转变，在单纯的病原体检测的基础上纳入了基础研究与教育培训的职能。

3 高等级生物安全实验室空调系统的冗余设计

高级别生物安全实验室均进行负压设计，防止病原微生物的泄漏。空调系统是实现高等级生物安全实验室维持负压环境的关键，也是实现生物安全实验室生物安全的重要技术保障。目前各国的规范都对高等级生物安全实验室的通风空调系统提出了冗余设计的要求。GB19489—2008《实验室生物安全通用要求》和GB50346—2011《生物安全实验室建筑技术规范》对高等级生物安全实验室通风空调系统提出了冗余设计的明确要求，主要包括送风机备用、排风机备用、排风2道高效过滤器等设计。GB19489—2008《实验室生物安全通用要求》条款6.3.3.12要求高等级生物安全实验室有备用排风机，GB50346—2011《生物安全实验室建筑技术规范》条款5.2.3至条款5.2.5要求高等级生物安全实验室设置备用送风机、备用排风机，且备用排风机应能自动切换，并保持切换时有序的压力梯度和定向流［10］。美国疾控中心发布的《微生物和生物医学实验室的生物安全》（第5版，2009年）对安全柜型实验室、正压型实验室和大动物生物安全三级实验室的送风机、排风机和排风高效过滤器等做了一定的要求，对生物安全四级实验室的通风空调系统冗余设计做出规定。加拿大2015年也颁布了《加拿大生物安全标准》（第2版）和配套的《加拿大生物安全手册》（第2版），但未对送排风冗余设计和备用做出明确要求。澳大利亚／新西兰颁布的《实验室安全》第三部分《微生物安全与防护》分别对生物安全四级实验室的通风空调系统冗余设计做了要求，但未对三级生物安全实验室的冗余设计有明要求。与美国疾控中心发布的要求类似，世界卫生组织发布的《实验室生物安全指南》对生物安全四级实验室冗余设计提出了明确要求，但未明确要求生物安全三级实验室冗余设计。中国高级别生物安全实验室的相关标准对通风空调系统的冗余设计要求高于WHO、美国、加拿大和澳大利亚／新西兰。

高等级生物安全实验室通风空调系统提出了冗余设计缺乏具体的技术要求和细节。如排风机方面，根据主排风机和备用排风机是否共用排风机箱有共用式和独立式（推荐），根据是否同时运行有1用1备的冷备式和两用互备的热备式。同时，送风机1用1备的方式有两类，分别为整个新风机组的完全备用和仅送风机段的冗余备用。另外，排风2道高效过滤器也有分散式和集中式。冗余设计可以确保实验室有效、可靠运行，但也会增加实验室建设成本。应统筹考虑国家标准要求和风险评估状况。

4 COVID-19流行背景下的生物安全实验室应用与管理

在COVID-19全球流行背景下，体液样本中新冠病毒的快速检测是及时控制传染源、切断传播途径和保护易感者的决策基础。在探索瑞德西韦、地瑞那韦等潜在化学治疗药物的基础上，开发针对新型冠状病毒的疫苗、治疗性抗体等生物治疗手段对疾病的预防及治疗具有重要的价值。上述的样本检测、疫苗开发和治疗性抗体研发等过程均涉及高等级生物安全实验室的使用［11］。

由于患者感染新冠病毒至临床出现明显症状具有一定的潜伏期，因此，对体液样本中新冠病毒的快速检测结果是实行传染源控制、传播途径切断和易感者保护的决策基础［12］。新冠病毒检测实验操作要基于相应的风险评估来执行。所有样品的起始操作步骤必须在经验证的生物安全柜或其他防护设施中进行，涉及病毒的培养、分离及中和实验均应在BSL3级生物安全实验室中进行。

疫苗主要通过模拟疾病因子来激活机体自身的免疫系统，建立体内活跃的防御机制来应对未来可能的感染。新型冠状病毒疫苗的研发对控制COVID-19疾病的流行、保护易感人群的作用是第一位的。目前已有多家大型制药公司进行了新型冠状病毒疫苗的研发，如赛诺菲巴斯德（Sanofi Pasteur）与Translate Bio合作开发用于COVID-19的新型mRNA疫苗。2020年3月16日，由我国军事医学科学院陈薇院士课题组研制的重组新冠疫苗已获批启动展开临床试验。疫苗研发通常包括两个阶段，①疫苗前期研发过程，包括获得活病毒、分离相关亚单位、通过基因重组获得重组蛋白、临床前独立研究等，②疫苗研发及注册过程。应当指出的是，分析新型冠状病毒毒株信息是启动新型冠状病毒疫苗研发的第一步。中国疾病预防控制中心2020年1月7日及12日分别从临床样品和环境样本中成功分离了新型冠状病毒。分离新型冠状病毒毒株需要在高级别生物安全实验室中进行。分离毒株后进行种子毒株筛选也是新型冠状病毒疫苗研发的重要步骤，此过程也需要在高级别生物安全实验室中进行。除了上述过程，疫苗研制过程还涉及疫苗株培养、样本检测和效果验证等多个流程，这些过程中均有操作步骤需要在高级别生物安全实验室中进行。

目前尚无治疗新冠病毒的特效治疗药物，针对新冠病毒的疫苗正处于研发和临床阶段。特异性的治疗抗体已成为治疗新冠病毒的新思路［13-14］，且新冠肺炎诊疗方案（试行第七版）新增了血清抗体检测、免疫治疗的方法［15］。报道称中国生物已完成对部分COVID-19康复者血浆的采集工作，正开展新冠病毒特免血浆制品和特免球蛋白的制备过程。新冠病毒感染患者接受抗体治疗12～24 h后，实验室主要的炎症指标水平明显下降，淋巴细胞比例上升，且患者血氧饱和度、病毒载量等重点指标全面向好，临床体征和症状明显好转。在特异性治疗抗体研发阶段，需进行严格的血液生物安全性检测、病毒灭活、抗病毒活性检测等过程。为保护研发人员安全、防止新冠病毒的扩散，这些过程均需在高等级生物安全实验室内进行。同时，新冠特免血浆制品是由康复者捐献的含高效价新冠病毒特异性抗体的血浆，需经过病毒灭活处理，并对抗新冠病毒中和抗体、多重病原微生物检测后制备而成，用于新冠肺炎危重患者的治疗。这些过程均需用到高级别生物安全实验室。

5 结语

生物安全管理体系的技术要素和管理要素是确保高级别生物安全实验室生物安全的关键。管理要素包括潜在污染的周期性评估、失活验证试验、分子诊断试验的无生物风险阳性对照、微生物的不同密闭措施以及生物安全文化。我国虽然已经在高等级生物安全实验室建设和管理方面取得了较大的进步，在预防、控制烈性传染病方面发挥了关键的作用。但也应看到，存在一定的问题，主要表现在：关于高等级生物安全实验室建设、管理和运行等方面的法律、法规较少；与欧美等国家相比，我国BSL-4生物安全实验室数量少，经验不足；缺少同时掌握生物安全技术、硬件管理和设施设备维护的复合型人才。

在COVID-19全球流行背景下，体液样本中新冠病毒的快速检测是传染源控制、传播途径切断和易感者保护的决策基础。在缺乏特效治疗药物的背景下，开发针对新型冠状病毒的疫苗、治疗性抗体等生物治疗手段对疾病的预防及治疗具有重要的价值。这些过程中多个步骤均涉及高等级生物安全实验室的使用。因此，在今后相当长一段时间内，需要建立和完善生物安全相关的法律法规，建立一批BSL-4生物安全实验室，并以BSL-4S生物安全实验室为核心，形成均衡的高等级生物安全实验室布局；同时加大高等级生物安全实验室硬件投入，优化资源配置，实现资源效益的最大化。另外，加强外部人才引进与内部人才培养，形成一批高等级生物安全实验室复合型人才也是高级别生物安全实验室管理和应用的重要方面。

在党的坚强领导下，全面贯彻党的教育方针，坚持马克思主义指导地位，坚持中国特色社会主义教育发展道路，坚持社会主义办学方向，立足基本国情，遵循教育规律，坚持改革创新，以凝聚人心、完善人格、开发人力、培育人才、造福人民为工作目标，培养德智体美劳全面发展的社会主义建设者和接班人，加快推进教育现代化、建设教育强国、办好人民满意的教育。

——2018-09-10习近平在全国教育大会上的讲话