椎间盘退变动物模型的研究进展*

张欣怡 杨艳妮 姬笑颜 李含笑 刘西纺,2

(1.陕西中医药大学第一临床医学院研究生院，咸阳 712046)(2.西安交通大学医学院附属红会医院神经脊柱病区，西安 710054)

颈肩腰腿痛是常见的肌肉骨骼系统病痛，给个人、家庭和社会带来一定的精神压力和经济负担。其预防、发病机制及治疗一直是公共卫生领域研究的热点。虽然多种因素均可引起颈肩腰腿痛的发生，但椎间盘退变(intervertebral disc degeneration，IDD)是其发病的主要原因之一[1]。椎间盘是人体最大的无血管结构，由髓核、纤维环和软骨终板构成，为脊柱的运动和负荷提供结构支撑。椎间盘退变的原因复杂多样，主要包括衰老、机械压力、吸烟、肥胖、感染、创伤、遗传等。退变的椎间盘表现出椎间高度的降低、纤维环出现裂隙或断裂、髓核胶原蛋白和水分的丢失、椎体终板的钙化等结构的改变，继而出现膨出、突出、脱垂等病理变化，在相应部位出现颈肩部疼痛、腰腿痛等临床表现。利用椎间盘退变动物模型可以经济有效地进行病因病机和治疗方法的研究。因此，建立操作简便、可控性强、符合人类解剖及生理特征且能再现椎间盘退变的客观规律的动物模型有助于开展医学实验研究。对目前主要的椎间盘退变模型进行分类归纳及总结，以期为研究者选取椎间盘退变动物模型提供参考。

1 实验动物的选择

模型动物的选择直接影响动物模型的构建效果，因此模型动物的选择具有十分重要的意义。动物模型的制备对于了解疾病的产生机制及作用过程具有相当重要的作用。这就要求动物模型必须是合乎伦理的、可控制的、具有重复性和成本效益，并且能够充分模拟正在研究的人类病理过程[2]。椎间盘退变动物模型应能够再现椎间盘退变的客观规律，截至目前用于构建椎间盘退变的动物有10多种，主要包括鼠、兔、羊、犬、猪、猴、狒狒等。由于鼠和兔来源充足、易于饲养、品种纯正、实验成本低等优点，是椎间盘退变模型的首选动物，但其脊柱构造及生物力学特性与人类有一定的差异。其中由于小鼠体型小，生命力较弱，对手术的耐受性差，在模型制作过程中死亡率也较高。因此，鼠和兔作为椎间盘退变的模型动物也具有一定的局限性。羊、猪、犬等大型哺乳动物的椎间盘与人类椎间盘在大小上合适，但其为四足动物，椎间盘受力与人类不一致而无法体现力学因素在椎间盘退变过程中的重要作用，虽然有研究者采用人为办法迫使其直立行走，但由于经济成本高、技术要求严格、饲养不便等缺点，未在椎间盘退变动物模型构建过程中大量使用。灵长类动物是人类椎间盘退变研究最理想的选择，其与人类一样都是双足直立行走，椎间盘结构及受力环境与人类高度相似，但由于价格昂贵及动物实验伦理道德等因素限制，无法得到广泛应用。不同的实验项目有不同的目的和要求，因而每项研究都应该选择最合适的实验动物，从而以最小的代价获得最好的结果。每种动物有不同的生理特点，根据实验目的、实验条件及经费预算等进行模型动物的选择。

2 模型建立的方法

2.1 诱发性椎间盘退变动物模型

2.1.1结构损伤模型

2.1.1.1 机械损伤模型：机械损伤主要通过外科手术干扰髓核、纤维环及软骨终板引起椎间盘的退变。其中细针穿刺法因操作简便、造模结果可靠、椎间盘退变程度易于控制而得到广泛的应用。Kim等[3]使用18G、21G和23G三种不同型号的穿刺针在透视引导下行兔L3～L4、L4～L5及L5～L6椎间盘纤维环穿刺结合髓核抽吸发现，21G穿刺技术在较短的时间内造成椎间盘退变的效果更好。Glaeser等[4]在大鼠椎间盘退变模型的优化研究中也发现21G穿刺技术致椎间盘退变的效果及可重复性均较好。损伤髓核与纤维环致退行性变发展缓慢便于观察及干预, 其穿刺针的型号、进针的深度需要进行精确计算，其最大的缺点是髓核组织丢失导致发生退行性变的过程与自然退行性变有较大的差别，不能全面反映椎间盘退行性变机制[5]。Vadala等[6]通过对12只成年绵羊经椎弓根入路，从终板向髓核钻2 mm的通道，进行部分髓核切除术，建立了一个纤维环完整的椎间盘逐步退变的动物模型，可用于研究髓核再生及早期轻度椎间盘退变的再生修复。软骨终板是椎间盘获取营养物质的主要通道，软骨终板的损伤也会引起椎间盘的退变。无水乙醇是微循环破坏试剂，具有去血管化作用，终板下注射可阻碍椎体-终板营养[7]。白荣飞等[8]通过针刺纤维环、终板注射无水乙醇及针刺联合终板注射三种方法建立大鼠椎间盘退变模型，从椎间盘相对高度、椎间盘组织病理学检查及免疫组织化学染色评价椎间盘退变，发现终板注射法较针刺纤维环法更早引起退变，12周后两种造模方法无显著差异，而联合组则可明显加快并加重椎间盘的退变并有效缩短实验周期。

2.1.1.2 化学损伤模型：化学损伤法是将一些化学物质注入椎间盘，引起髓核和纤维环的损伤或变性，从而达到椎间盘退变的目的。Lotz[9]向鼠椎间盘髓核内注射木瓜凝乳蛋白，3周后发现椎间隙变窄、磁共振T2加权像信号强度降低，提示椎间盘发生退变。Muramatsu等[10]将糖胺聚糖降解酶——condoliase注射入食蟹猴椎间盘中，引起了髓核、纤维环、软骨终板和骨骺生长板的退变和坏死；骨骺生长板灶性消失以及软骨终板的新生血管化和骨化，与木瓜凝乳蛋白酶引起的变化在性质上相似，但范围更加广泛。Hoogendoorn等[11]向羊椎间盘内注射0.25 U/mL软骨素酶ABC致髓核蛋白多糖裂解，且羊椎间盘内缺乏脊索细胞，与人类椎间盘相似，在18周内成功建立了一种缓慢的、可重复性的且与人类椎间盘退变相似性极强的椎间盘退变模型。Liu等[12]利用微创微量注射技术将FN-f注射到兔椎间盘中，通过上调MMPs、iNOS及TNF-1导致软骨损伤，在4周时开始出现早期退变，后期髓核被纤维组织完全替代，成功建立了重复性好、操作简便且性价比高的椎间盘退变模型。Wei等[13-14]将博来霉素经皮注射到恒河猴邻近椎间盘的软骨下或在CT引导下将平阳霉素注射到兔腰椎间盘邻近的软骨下骨中,采用影像学、组织化学和分子生物学等方法评估椎间盘退变，成功诱导与人类椎间盘退变相似的缺血性慢进性椎间盘退变模型。

2.1.2力学改变模型

2.1.2.1 应力改变模型：生物力学在椎间盘退变过程中具有重要作用。在生理情况下椎间盘承受身体的垂直静压力及在运动过程中的水平剪切力，维持椎间隙高度使相邻两椎体的活动度在正常范围内。异常的力学会导致椎间盘内反常的力分布和渗透压平衡的破坏，被认为是椎间盘退变的重要发病因素[15]。Lao等[16]发现小鼠在用下肢站立和跳跃时的运动模式与人类相似，采用自制热板笼提供脊柱轴向生物力学载荷，随着时间的延长和生物力学载荷的增加，纤维环处裂隙逐渐增大，椎间盘和软骨终板高度均降低，细胞外基质成分改变，形成退变模型。Ao等[17]是利用小鼠的恐水性，在有限的含水空间内诱导小鼠主动采取两足站立姿势，10周后椎间盘退变严重，主要表现为纤维环和关节突关节的退变，成功建立了一种无创的、有效的与人类相似的椎间盘退变小鼠模型。Wang等[18]通过椎弓根螺钉和棒植入固定羊L3～L4椎间盘，保持椎间盘完整、软骨终板未被破坏，导致其椎间盘负荷环境发生变化，从而诱导椎间盘的退变。Xia等[19]在大鼠尾椎中经皮插入两根克氏针，使尾椎弯曲而施以静态压缩载荷，他们发现随着负荷量的增加，静态压迫导致MRI T2加权像上细胞核强度进行性降低，聚集素和Ⅱ型胶原表达减少，MMP-3和MMP-13表达增加，组织形态发生变性，形成了退变模型。

2.1.2.2 脊柱失稳模型：此类模型是通过破坏椎间盘周围结构，打破脊柱的动静态平衡，使脊柱过度运动而产生脊柱不稳。付方达等[20]通过手术去除小鼠棘上和棘间韧带致其脊柱轴线力学失稳来诱导构建椎间盘退变模型，术后4周见椎间盘高度明显下降、纤维环排列紊乱、MMP-13表达增加等，出现椎间盘退变特征，成功建立椎间盘退变小鼠模型。Fukui等[21]通过完全切除L4～L5双侧小关节，术后7周发现L4～L5节段椎间盘高度增加，终板不规则，相邻节段椎间盘高度降低，组织学评分高于对照组，出现椎间盘退变征象。

2.1.3基因敲除模型:近年来，随着基因工程技术的发展，基因对椎间盘的重要作用可以从各种转基因鼠中得到证实，为椎间盘退变提供了新的选择。有研究[22-23]描述了一种SPARC基因缺失小鼠，早在3个月大的时候就出现了运动引起的不适迹象及下背部和后掌对冷刺激的超敏反应，且椎间盘退变程度随着年龄的增长而发展，可作为椎间盘退变所致慢性疼痛的重要动物模型。Lin等[24]研究发现一种肌腱/韧带特异性标志物和抗血管生成因子——Tnmd基因敲除小鼠，早在6月龄时出现椎间盘退变征象，同时报道了Tnmd和Chm1双基因敲除小鼠不仅表现出加速的椎间盘退变,而且还表现出椎间盘的异位成骨。Wu等[25]研究HIF-1a基因在小鼠椎间盘退变中的作用，结果显示基因敲除组小鼠椎骨内糖胺聚糖减少及Ⅱ型胶原蛋白减少和血管内皮生长因子的表达减少。特定基因敲除模型证明了遗传或基因因素是导致椎间盘退变的因素之一，但其只强调了某个单一基因的作用，且其技术难度较高、操作复杂、可重复性不佳及模型受限，所以该领域研究相对较少。

2.1.4缺血模型:椎间盘无血管结构，是从相邻椎体的血管网络接受其营养物质及进行代谢物质的交换，骨性终板为营养物质向椎间盘的输送提供了主要途径[26-27]。之前有研究在犬模型中，用骨水泥堵塞终板营养通路长达70周，并且没有发现椎间盘产生明显的退变[28]。Kang等[29]证明在幼猪模型中，通过骨水泥干预阻断双侧终板通路3个月后引起椎间盘退变，但其阻断终板营养通路对椎间盘退变的影响尚不清楚，也存在争议。现有研究者[30-31]向山羊的两个腰椎间盘(L2～L3和L3～L4)注射骨水泥阻断双侧终板营养通路，干预48周后，椎间盘出现严重退变，建立了骨水泥注射阻断双终板营养通路的成熟山羊模型。虽然缺血性干预措施的长期作用还有待观察，但它提示了营养障碍在椎间盘退变中起作用的重要信息。此外，缺血模型对于评估新的椎间盘退变和修复的生物学干预措施也有重要意义。

2.1.5其他模型:吸烟被认为是椎间盘退变的主要危险因素之一[32-33]。Iwahashi等[34]将稀释后的尼古丁溶液注射到兔皮下8周后发现，髓核细胞破坏、纤维环紊乱及蛋白多糖的合成减少，提示尼古丁毒性导致了椎间盘的退变。吴磊磊等[35]通过对大鼠皮下注射尼古丁，5周后同样发现椎间盘退变的征象，并且指出尼古丁加速椎间盘退变的机制可能与抑制AQP1及AQP3表达有关。Fields等[36]发现2型糖尿病大鼠出现了椎间盘软骨终板细胞代谢障碍、骨化和生物力学行为变化等退变征象。

2.2 自发性椎间盘退变动物模型

Silberberg等[37]首先发现了与人类椎间盘退变相似的地中海沙鼠椎间盘的变化，认为沙鼠高盐少水的饮食引起代谢产生一定的变化，从而引起椎间盘的退变尤其是髓核功能的异常。沙鼠椎间盘退变发生早、发生率高且有一定的遗传倾向。自发性椎间盘退变模型与年龄有一定的关系，Ohnishi等[38]通过Pfirrmann分级、MRI成像和椎间盘组织学评分发现C57BL/6小鼠在14月龄时开始出现轻度椎间盘退变，22月龄时退变程度达到中重度。Vincent等[39]也发现与3月龄和12月龄的小鼠相比，24月龄的小鼠表现出典型的椎间盘退变。Choi等[40]首次报道了SM/J小鼠，在椎间盘退变自发性SM/J小鼠中，髓核细胞减少、基质成分改变、椎间盘高度降低、椎体骨质量差等，概括了人类椎间盘退变的许多显著特征，是一种新的椎间盘退变小动物模型。此类模型在一定程度上减少了人为因素的影响，但其退变原因及致病机理尚不清楚，在作为动物模型的应用中受到了限制。

3 小结与展望

椎间盘退变是颈肩腰腿痛的病理基础，椎间盘退变性疾病可以归入中医“痹症”范畴。由椎间盘退变引起的颈肩腰腿痛，肝和肾与其有较为密切的关系，肝主筋、肾主骨且精血同源，肝肾亏损是椎间盘退变的病机之一。椎间盘退变模型研究发展迅速，但鉴于人类椎间盘退变是随着年龄增长而发生的复杂性退行性变化，实验动物模型与临床中人的椎间盘退变有很大差异。目前尚没有一种模型可以完全复制人类椎间盘退变，每一种椎间盘退变模型都有其局限性。

在现有研究中，椎间盘结构损伤模型最为常见，其中细针穿刺法因操作易行、重复性好及造模时间相对较短等优点，成为研究椎间盘退变的常用手段，但其模型不适用于早期干预研究。自发性椎间盘退变模型因与人类椎间盘退变相似度较高，是研究人类椎间盘退变的有利选择，但由于动物物种和数量的限制，其使用并不广泛。虽然每一种动物模型都有其局限性，但根据不同的研究需求我们可以选择更具优势的动物模型。随着科学技术的发展及研究者们对椎间盘退变的不断深入了解与探索，对椎间盘退变的动物实验研究不仅限于西医以“病”来建立模型，还可以根据中医不同的证型来建立模型，相信一定会构建出一种比较规范且与人类椎间盘退变相似的理想椎间盘退变动物模型，以期为临床预防和治疗人类椎间盘退变提供坚实的研究基础。