四川石渠县牦牛源蜱的形态学及分子生物学鉴定

邓兵，唐天才，向阳

（1.四川省绵阳市安州区动物疫病预防控制中心，四川 安州 622650；2.宜宾学院，四川 宜宾 644000；3.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041）

石渠县地处青藏高原东部，四川省西北部，是草地资源丰富的纯牧业县，牦牛饲养规模居全省前列[1]。蜱虫是当地牦牛体表最为常见的体外寄生虫，也是多种病毒、细菌、螺旋体、立克次氏体和原虫的贮存宿主及传播媒介[2-3]。

蜱虫的鉴定通常借助于光学显微镜观察，但仅通过传统的形态学鉴定方法难以对其进行准确鉴定[4]。近年来，随着分子生物学的快速发展，对蜱虫的鉴定多采用形态学加分子生物学相结合的手段。石渠县当地牧民与牦牛接触密切，存在被蜱虫叮咬而感染蜱传疾病的风险。因此，开展石渠县牦牛源蜱的鉴定对防控当地动物疾病和人畜共患病具有积极的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本采集 2018 年3～8 月，分别在石渠县阿日扎乡、麻呷乡、长须干玛乡和德荣玛乡4个乡的牦牛体表采集蜱虫。为了让样本具有代表性，采集样本时应在不同的乡选取2～3个不相邻的村，每个村选择2～3个不相邻的牦牛群。从每头牦牛体表采集蜱虫5～6 只，装入收集管后5 d内送至西南民族大学兽医寄生虫实验室，经形态学鉴定后加入75%乙醇溶液，置4 ℃冰箱中冷藏待检。

1.1.2 主要试剂 组织基因组DNA 提取试剂盒（EasyPure Genomic DNA Kit）；Trans 2K Plus DNA marker、2×EasyTaq PCR SuperMix（北京全式金公司）。引物合成及测序均由生工生物工程技术服务有限公司（成都公司）完成。

1.1.3 主要仪器 Leica 体式显微镜（S9D），Bertin Precellys 24 研磨器，Eppendorf 台式高速离心机（5402 型），Bio-Rad 伯乐梯度PCR 扩增仪（RTC240型），北京六一仪器厂电泳仪（DYY-6），全自动数码凝胶图像分析系统（Tanon 5200 Multi）。

1.2 方法

1.2.1 形态学分类 根据《中国经济昆虫志》（第十五册）[5]和《中国畜禽寄生虫形态分类图谱》[6]中对蜱虫形态学的描述，使用体式显微镜分别对雌蜱和雄蜱进行形态学鉴定。主要对蜱虫的背面、腹面、假头、假头基、盾板、雄蜱肛侧板、雌蜱孔区、气门板和生殖孔进行观察，并做好记录。经形态学初步鉴定后，选取其中20%形态结构不同且采样点不同的蜱进行分子生物学鉴定。

1.2.2 DNA 提取 从75%酒精溶液中取出待检蜱虫样本，用无菌生理盐水反复洗涤3次，用吸水纸擦干后沿蜱的纵向中轴线切开。其中半只放入-80 ℃冰箱内保存，余下半只置于研磨器中加入500 μL 无菌水进行充分研磨。研磨器设置参数如下：每管加入直径0.5 mm 和2 mm 的陶瓷珠20珠和5珠，5 500 r∕min研磨2次，4 000 r∕min研磨1 次。取200 μL 研磨液，按照EasyPure Genomic DNA Kit 试剂盒说明书中的方法提取蜱DNA，置-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2.3 PCR 检测 参照Ondrejicka 等[7]报道的方法对蜱进行分子鉴定，引物信息见表1。

表1 PCR引物信息

PCR 扩增体系如下：模板1 μL，上游引物、下游引物各1 μL，2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL，充分混匀。设阳性对照和阴性对照（去离子水）。蜱COI 基因扩增程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸55 s，40 个循环；72 ℃延伸8 min；16 ℃保温。

1.2.4 序列分析及统计分析 将全部阳性样品送至生工生物工程公司测序，使用DNA Star软件对所得全部序列进行拼接分析，在NCBI 网站中使用BLAST 进行比对，再使用MEGA 6.0 软件以Neighbor-Joining 法（Bootstrap 值1 000）构建分子进化树。

2 结果

2.1 样本采集数量及形态学鉴定 在阿日扎乡、德荣玛乡、麻呷乡和长须干玛乡分别采集到成蜱168 只、192 只、224 只和234 只，共818只。经形态学初步鉴定，本次采集的蜱虫有2个种，分别是青海血蜱和西藏革蜱，形态学特征见表2。其中青海血蜱的比例为21.03%（172∕818），西藏革蜱的比例为78.97%（646∕818），见表3。

表2 青海血蜱和西藏革蜱的形态学特征

表3 采样点的蜱种类及数量只

2.2 蜱的分子鉴定

2.2.1 蜱COI 基因扩增 以提取的蜱DNA 为模板，采用常规PCR方法扩增蜱的线粒体细胞色素C 氧化酶亚基I（COI）基因片段，结果在658 bp 左右处出现条带，与预期片段大小相符。详见图1。

图1 蜱COI基因扩增结果

2.2.2 蜱COI 基因遗传进化分析 将测序所得的全部序列进行拼接、比对后共得到5 条序列，其中1条为青海血蜱（H.qinghaiensis.Shiqu），其余4 条为西藏革蜱（D.everestianus.Shiqu 1、D.everestianus.Shiqu 2、D.everestianus.Shiqu 3、D.everestianus.Shiqu 4）。选取经BLAST 比对后同源性最高的1～2 条序列已确定种（即青海血蜱及西藏革蜱），在NCBI中选取分离自不同地区的青海血蜱和西藏革蜱的COI 基因序列，再选取几个其他种的血蜱和革蜱的COI基因序列作为参考序列，构建分子进化树（见图2）。从图可知，分离株D.everestianus.Shiqu 1、D.everestianus.Shiqu 2、D.everestianus.Shiqu 3、D.everestianus.Shiqu 4与西藏革蜱（KJ396938）聚为一支，同源性达98.0%～99.5%。分离株H.qinghaiensis.Shiqu与甘肃天祝青海血蜱分离株（MF981066）和甘肃临洮青海血蜱分离株（MF981034）聚为一支，同源性达99.09% ；与青海湟源青海血蜱分离株（MF981069）、甘肃永靖青海血蜱分离株（MF982056）的同源性分别达98.63%、98.48%。

图2 蜱COI基因系统进化树分析

3 讨论

通过光学显微镜或扫描电子显微镜对蜱进行形态学鉴定的传统方法易受主观因素的影响，且难以对某些形态学特征相似的虫种进行准确区分[8]。近年来，随着分子生物学技术的快速发展，该技术已被广泛运用于寄生虫的虫种鉴定。通过PCR 扩增及测序，可在基因水平上对蜱种进行鉴定，具有特异性强、准确度高等优点。本研究就采用形态学加分子生物学相结合的方法对石渠县牦牛体表寄生的蜱进行了虫种鉴定。

COI 基因是线粒体DNA 上一段保守的蛋白质编码基因，近年来被广泛运用于寄生虫的种类鉴定[9]。本研究以蜱COI 基因序列设计引物，经普通PCR 鉴定，对测序结果进行分析，结果表明石渠县牦牛体表寄生的蜱虫为青海血蜱和西藏革蜱，其中青海血蜱的占比为21.03%，西藏革蜱的占比为78.97%。说明西藏革蜱是石渠县牦牛体表寄生蜱的优势虫种，这可能与西藏革蜱和青海血蜱的生活习性、采集地的海拔、降雨量、气候等因素有关。在本次调查的4 个乡中，仅麻呷乡鉴定出了青海血蜱，可能与当地气候、海拔和驱虫药的使用等因素有关。

4 结论

本研究对石渠县牦牛源蜱开展了形态学鉴定和分子生物学鉴定，鉴定结果表明，石渠县存在青海血蜱和西藏革蜱，其中西藏革蜱是当地牦牛体表寄生蜱的优势虫种。接下来笔者建议进一步扩大石渠县家畜体表蜱的调查范围和样本采集数量，以期为石渠县动物疾病及人畜共患病的防控提供更确实的数据。