基于食管癌分子分型液体活检技术的研发和推广应用

王盼盼，赵学科，李秀敏，钟 侃，胡景峰，宋 昕，王 伟，李欣然，杨苗苗，徐瑞华，魏梦霞，韩文莉，雷玲玲，孟超龙，胡守佳，程 锟，李留玉，张立国，李志强，刘太江，张高富，陈志国，李喜琴，王立东

(1. 郑州大学第一附属医院河南省食管癌重点开放实验室、省部共建食管癌防治国家重点实验室，河南 郑州450052；2.新乡医学院第三附属医院消化内科，河南 新乡 453000；3.新乡医学院河南省肿瘤分子治疗医学重点实验室，河南 新乡 453003；4.新乡市中心医院胸外科，河南 新乡 453000；5.辉县市第三人民医院(孟庄镇卫生院)肿瘤科，河南 新乡 453621；6.新乡同盟医院肿瘤科，河南 新乡 453800；7.辉县市共济医院肿瘤科，河南 新乡 453600)

食管癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一，发病率仅次于胃癌，90%以上为食管鳞癌[1]。临床上首次确诊的食管癌患者约90%以上为中晚期，食管鳞癌总体5 a生存率仅15%左右[2]，其主要原因是早期食管癌患者无特异性症状，缺乏无创性早期诊断的筛查策略。迄今为止，早期食管癌及癌前病变筛查仍为色素内镜检查加病理活检，其过程痛苦、技术要求高、患者依从性差，难以大范围推广。食管癌变是一个多阶段演进过程，食管癌前病变形态发展之前已发生多种基因和蛋白的改变，包括来自肿瘤细胞的一组特异蛋白，后者可以导致宿主细胞产生抗原抗体反应，这一组蛋白称为肿瘤相关抗原[3-4]。因此，检测外周血肿瘤相关抗原自身抗体可能有助于高危人群筛查和早期发现。过去一些相关研究大多集中在单个肿瘤相关抗原自身抗体检测或组织中肿瘤相关抗原检测，导致早期癌检出率过低。因此，本研究旨在联合检测多种肿瘤相关抗原自身抗体，阐明这些标志物对食管癌高危人群预警筛查和早期发现的意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料入组研究对象为3组，收集时间为2010年1月至2019年12月。第1组：郑州大学第一附属医院收治的100例早期食管鳞癌患者(食管癌组)及100例正常人(正常对照组)。食管癌组均为经病理确诊且未接受任何放化疗的初诊患者，男54例，女46例，年龄35～69(58.98±7.24)岁；正常对照组来自门诊健康体检人群，并经内镜病理活检排除食管癌前病变或早期食管癌，无任何肿瘤相关证据，男51例，女49例，年龄35～70(57.88±7.71)岁。2组研究对象的性别、年龄等基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。第2组(验证组)：接受流行病学调查和家访的400例无症状人群来自食管癌高发区河南新乡大块镇，男201例，女199例，年龄35～70(53.30±9.71)岁(表1)。第3组(推广应用组)：独立于验证组的食管癌高发区无症状人群，入组标准同验证组，主要来自河南新乡食管癌高发区的3个自然村，共10 752例，男5 433例，女5 319例，年龄35～70(53.23±9.90)岁(表2)。所有研究对象均排除急性感染、过敏、自身免疫性疾病等影响血清蛋白质表达的疾病。所有入组研究对象均签署知情同意书。该研究已被郑州大学第一附属医院伦理委员会批准。

表1 验证组400例无症状人群性别、年龄分布情况

表2 推广应用组10 752例无症状人群性别、年龄分布情况

1.2 方法

1.2.1 样品收集 3组人群均取空腹静脉血5 mL至离心管中，室温静置30 min，2 000 r/min离心20 min，取血清并每管100 μL分装，干冰保存，后转至-80 ℃冰箱内储存备用。

1.2.2 血清肿瘤相关抗原自身抗体检测 所有样品血清肿瘤相关抗原自身抗体的酶联免疫吸附试验均是在不获取样品对应临床信息的前提下进行的。用美国Scripps研究所自行提取和纯化的细胞周期蛋白E(CyclinE)、信号转导与转录激活因子3(STAT3)、细胞周期相关转录因子1(E2F1)、胰岛素样生长因子2 mRNA-结合蛋白1(IMP1)和P65等共5种抗原对以上血清标本进行肿瘤相关抗原自身抗体水平检测。采用本实验室已建立的间接酶联免疫吸附试验方法[5-6]，各包被抗原的稀释终浓度为0.5 μg/μL，血样稀释浓度为150，辣根过氧化物酶标记的抗人IgG稀释浓度为15 000。在酶联免疫吸附试验板孔中加入用包被稀释液稀释过的抗原100 μL/孔，4 ℃过夜(>24 h)。加入稀释后的患者血清100 μL/孔，每个样品至少做2次检查，37 ℃孵育。已知阳性的血清为阳性对照，包被缓冲液为阴性对照。加入稀释的辣根过氧化物酶标记的抗人IgG 100 μL/孔，37 ℃孵育。加入四甲基联苯胺-过氧化氢尿素显色液，100 μL/孔，置于37 ℃避光反应，当阳性对照出现明显颜色变化后，每孔加入终止液50 μL终止反应，并在酶联免疫吸附试验读数仪上读取450 nm波长处光密度值。

1.2.3 血清肿瘤相关抗原自身抗体检测结果判定 采用美国Scripps研究所判定方法确定截断值，读数在此值以上的为阳性，否则为阴性[7-8]。

1.2.4 色素内镜检查和黏膜活检 对验证组所有对象、推广应用组中液体活检检测5种肿瘤相关抗原自身抗体有至少1种阳性者进行色素内镜检查和黏膜活检，并常规在食管中1/3段(距门齿28～30 cm)、下1/3段(食管贲门交界线上2～3 cm)各取1～2块活检组织，并在肉眼可见的病变处随机取材，必要时进行食管黏膜碘染色。在食管不染区取材，所有活检组织均迅速置于体积分数95%乙醇内固定。常规脱水后石蜡包埋，连续切片6张，每张切片厚5 μm，其中1张进行HE染色，核实组织病理学诊断，其余5张行免疫组化检查。根据细胞形态、组织结构及免疫组化检查结果，将食管黏膜上皮分为正常、不典型增生和鳞癌。

2 结果

2.1 食管癌组和正常对照组血清5种肿瘤相关抗原自身抗体表达比较食管癌组血清CyclinE、STAT3、E2F1、IMP1和P65等5种肿瘤相关抗原自身抗体阳性率均高于对照组，差异均有统计学意义(χ2=7.779，P=0.005；χ2=14.222，P<0.001；χ2=13.211，P<0.001；χ2=13.455，P<0.001；χ2=26.510，P<0.001)。5种肿瘤相关抗原自身抗体联合检测至少1种阳性用于食管癌诊断的敏感性为77.00%，特异性为87.00%。见表3。

表3 食管癌组和正常对照组血清肿瘤相关抗原自身抗体阳性率比较及对食管癌的诊断效能 n(%)

2.2 验证组400例无症状人群液体活检和色素内镜检查结果比较随食管癌前病变程度的加重，CyclinE、STAT3、E2F1、IMP1和P65联合液体活检技术至少1种阳性检出食管病变率呈增加趋势，而且出现多种肿瘤相关抗原自身抗体阳性现象。在验证组食管癌高发区400例无症状人群中，5种肿瘤相关抗原自身抗体联合液体活检技术检出食管癌8例(72.73%)、癌前病变22例(75.86%)，该方法用于食管癌诊断的敏感性为72.73%，特异性为86.94%。见表4。

表4 验证组400例无症状人群液体活检和色素内镜检查结果比较 n(%)

2.3 推广应用组10 752例无症状人群液体活检技术联合色素内镜检查结果利用液体活检技术对推广应用组食管癌高发区10 752例无症状人群进行大规模筛查，筛查出2 043例(19.00%)有至少1种肿瘤相关抗原自身抗体阳性者，定义为高危人群。高危人群进一步进行色素内镜检查，发现正常人群1 075例(52.62%)、不典型增生710例(34.75%)、食管癌258例(12.63%)。即在食管癌高发区无症状人群中进行液体活检技术联合色素内镜检查，食管癌检出率为2.40%(258/10 752)。

3 讨论

食管癌早期起病隐匿，缺乏特异性症状，其主要筛查手段仍是色素内镜检查和黏膜活检(具有技术要求高、有创、依从性差、效率偏低等劣势)，加上传统的高危人群界定标准精准度低(高发区、40岁以上、男性、吸烟、饮酒、家族史阳性)；当对高危人群进行内镜筛查时，早期癌发现率仅2%左右。这些原因使高发区无症状人群大规模筛查食管癌受到极大限制。

食管癌多阶段演进过程中产生的肿瘤相关抗原自身抗体可在患者出现主要临床症状之前的数月甚至数年即被检测到[9]。联合检测多种抗肿瘤相关抗原抗体对恶性肿瘤高危人群筛查和早期诊断具有一定的可行性[10-11]。本研究主要基于食管癌分子分型液体活检技术，优化组合出5种肿瘤相关抗原自身抗体(CyclinE、STAT3、E2F1、IMP1和P65)联合检测方法，通过食管癌患者与正常对照人群研究指标诊断的可靠性，并在食管癌高发区小规模人群中进行验证，之后将其在食管癌高发区独立的大规模无症状人群进行推广应用。

本研究结果显示：第1组的早期食管癌患者的5种肿瘤相关抗原自身抗体联合检测阳性率为77.00%，验证组中食管癌和癌前病变的阳性率分别为72.73%和75.86%，在推广应用组中有相似的结果。这提示利用血清肿瘤相关抗原自身抗体联合液体活检技术对食管癌高发区无症状人群进行检测，是一种非常有前景的食管癌高危人群筛查和早期诊断方法。这3组人群肿瘤相关自身抗体联合检测时均存在一定的假阴性率，可导致食管癌前病变和早期癌漏诊，提示未来我们的研究应进一步关注多种肿瘤标志物的优化组合，提高联合诊断敏感性。在第3组食管癌高发区无症状人群大规模推广应用中，通过对肿瘤相关自身抗体阳性者进一步行色素内镜检查发现，与单纯色素内镜检查的食管癌检出率相近。提示该方案在无症状人群大规模推广应用中具有显著的筛查诊断潜力。

总之，这是一项多中心、多阶段的大规模人群研究，主要基于食管癌分子分型液体活检技术，优化组合出5种肿瘤相关抗原自身抗体(CyclinE、STAT3、E2F1、IMP1和P65)联合检测方法，精准确定出食管癌高危人群，具有与色素内镜筛查相似效果，但极大减少了内镜筛查人数，节约了筛查成本，可作为食管癌高危人群预警和早期诊断的关键手段，在食管癌高发区无症状人群大规模筛查中应用具有明显的社会效益和临床意义。