贵州桐梓发现大别山林蛙

程彦林，刘京，陈龙，雷诗融，邹家伟，张霞，李仕泽

(茅台学院资源环境系，贵州仁怀564500)

蛙属Rana广泛分布于欧亚大陆和美洲，目前该属已报道51种(Frost，2020)，其中，中国记录分布25种，贵州省记录分布6种，分别为昭觉林蛙R.chaochiaoensis、徂徕林蛙R.culaiensis、峨眉林蛙R.omeimontis、威宁蛙R.weiningensis、镇海林蛙R.zhenhaiensis和寒露林蛙R.hanluica(中国两栖类，2020)。昭觉林蛙分布在贵州西部(伍律等，1986)，徂徕林蛙分布在贵州黄平等地(肖宁等，2019)，峨眉林蛙分布在贵州东部和北部(费梁等，2012)，威宁蛙分布在贵州西部威宁、水城等地(刘承钊等，1962)，镇海林蛙分布在贵州梵净山和雷公山(张雷等，2010；陈继军等，2014；魏刚等，2017)，寒露林蛙分布在贵州梵净山和雷公山(陈继军等，2017；魏刚等，2017)。

2019年7月，在贵州桐梓黄莲自然保护区进行两栖动物调查时，于保护区内(107°2′37.31″E，28°29′31.95″N，海拔1 666 m)采集到蛙属成体标本2号(表1)，经形态学比较和系统发育分析，鉴定为大别山林蛙R.dabieshanensis，为贵州省两栖动物新记录。本文对其形态特征及生态习性进行描述，并初步探讨其形态特征的地理变异，为蛙属物种的系统学和谱系地理学研究提供了新信息。

表1 样品信息表Table 1 Information of samples used in this study

1 材料与方法

1.1 材料

2号标本取肌肉组织保存于95%乙醇中，标本浸泡于10%福尔马林溶液中，保存于茅台学院生物学标本室。

1.2 形态鉴定与测量

对2号标本使用游标卡尺(200 mm，精度0.01 mm；无锡锡工量具有限公司)进行测量，测量依据《中国两栖动物检索及图鉴》(费梁等，2005),并参照《中国两栖动物及其分布彩色图鉴》(费梁等，2012)进行形态鉴定。

1.3 分子鉴定

以高盐法提取肌肉组织的DNA。利用引物P7和P8(Simonetal.，1994)PCR扩增16SrRNA基因部分片段(528 bp)并测序。PCR扩增条件和步骤参照Chen等(2017)。扩增产物经电泳检测后，大小符合要求的产物交上海生工生物公司测序。所得序列上传到GenBank，登录号为MT911420和MT911421。

在GenBank中下载蛙属部分物种和蛙科Ranidae部分相近物种的16SrRNA基因，结合本次采集标本所测序列，进行分子系统发育分析。以宝兴树蛙Zhangixalusdugritei、黑斑侧褶蛙Pelophylaxnigromaculatus为外群(Wangetal.，2017)。所有序列在Clustal X v1.8(Thompsonetal.，1997)中进行比对，采用贝叶斯法(Bayesian-Inference，BI)重建系统发育关系。建树之前，利用jModeltest v2(David，2008)基于AIC标准选择最适核苷酸替代模型。贝叶斯法运算中马尔科夫链的蒙特卡罗方法(Markov chain，MonteCarlo process)设置为4条链(3条冷链1条热链)同时运行，共运行10 000 000代，每100代抽样一次，共得到100 001个样本及其相对的似然值和模型参数。在运行500 000代后，似然值趋于稳定，舍弃最初的500 000代(5 000个样本)，用剩余的样本构建一致树，并获得系统树的支系结构和各支系的后验概率。用MEGA v6.0(Tamuraetal.，2013)中的Kimura双参数模型计算表1中所列蛙属物种间的遗传距离。

2 结果

2.1 形态描述

本次采集标本为成体雄性(TZ20160714018、TZ20160714019)，体型较大，体长53.9 mm和54.8 mm，其他部位量度见表2。吻端钝尖，头长略大于头宽，吻棱明显，瞳孔椭圆、横置，鼓膜明显，呈圆形，舌后端有明显缺刻。前臂粗壮，手指纤细，指端钝圆不膨大，指长序3>4>1≈2，内掌突椭圆形，小而明显，无外掌突；后肢细长，左右跟部重叠明显，胫跗关节贴体前伸达眼至鼻孔之间，趾长序4>3>5>2>1，趾端无沟，趾间具2/3蹼，趾关节下瘤明显:第四趾3个，第二、三、五趾各2个，第一趾1个。背部皮肤光滑，呈金色，背部有黑色斑点，背侧褶明显，从眼后角到腹股沟。生活时前肢、大腿、胫骨背侧面有灰褐色横纹，雄性婚垫灰褐色(图1，图2)。比较此次所采集的林蛙标本和其他蛙属物种的形态鉴定特征，发现本次采集的标本形态特征与大别山林蛙模式产地标本相符。

表2 贵州桐梓大别山林蛙成体标本形态量度Table 2 Morphometric measurements of adult Rana dabieshanensis in Tongzi,Guizhou Province

2.2 系统发育关系和遗传距离

PCR扩增获得线粒体16SrRNA基因片段长度为520 bp。T、C、A、G含量分别是25.9%、23.8%、29.7%、20.7%，A+T含量高于G+C。本文所用最适核苷酸替代模型为GTR+G+I。

基于贝叶斯算法构建系统发育树显示，采自桐梓的林蛙标本与大别山林蛙模式产地(安徽大别山)的标本聚为一支，且有较高的支持率(0.98)。基于Kimura双参数模型估算本研究中所采用的蛙属部分物种的遗传距离(表3)为1.2%～14.8%，平均遗传距离为8.1%。桐梓所采的林蛙标本与大别山林蛙模式产地标本间的遗传距离为0.6%～0.8%，远小于蛙属物种间的遗传距离。通过形态比较，在桐梓采集的林蛙标本与大别山林蛙原始文献(Wangetal.，2017)的描述吻合，系统发育分析也支持采自桐梓的林蛙标本与大别山林蛙关系较近。

因此，结合形态比较与分子系统学分析结果，确定采集于桐梓的林蛙标本为大别山林蛙，为贵州省两栖动物分布新记录。

2.3 生境描述

本次采集的大别山林蛙标本分布在桐梓黄莲自然保护区海拔1 650～1 700 m溪沟边树林茂密的草丛中，标本发现时在草丛边的道路上(图4)。与其同域分布的两栖类有棘腹蛙Quasipaaboulengeri、峨眉树蛙Zhangixalusomeimontis、经甫树蛙Zhangixaluschenfui和斑腿泛树蛙Polypedatesmegacephalus等。

3 讨论

蛙属物种在中国广泛分布，大多数物种间形态较为相似，因此在野外很难对其进行鉴定(费梁等，2012)。近年来，随着分子生物学的发展，采用形态比较结合分子系统学分析对物种进行鉴定的方法已广泛应用。

目前贵州省记录的蛙属物种6种，即昭觉林蛙、徂徕林蛙、峨眉林蛙、威宁蛙、镇海林蛙和寒露林蛙(中国两栖类，2020)。本文通过GenBank下载贵州已有报道的林蛙及其近缘种的16SrRNA序列，构建系统发育树，计算遗传距离，发现本文采集的标本和贵州省有记载分布的昭觉林蛙、徂徕林蛙、峨眉林蛙、威宁蛙、镇海林蛙和寒露林蛙的遗传距离分别为3.8%、1.2%、3.8%、14.8%、1.2%和2.5%，和大别山林蛙模式产地标本的遗传距离仅为0.6%和0.8%，仅较镇海林蛙与徂徕林蛙间的遗传距离大(0.4%)，远小于其他蛙属物种的遗传距离。但有研究认为徂徕林蛙与镇海林蛙处于物种分化过程中的并系阶段，其物种分化还未完全完成(杨宝田等，2013)。因此，本文遗传距离比较不将徂徕林蛙和镇海林蛙纳入。

采自桐梓的林蛙标本与贵州已记载的6种蛙属物种在形态上也存在明显差异。头体长53.9～54.8 mm，可区别于威宁蛙(35 mm左右)；无雄性线，区别于峨眉林蛙(有雄性线)和昭觉林蛙(有粉红色雄性线)；颞褶明显，区别于徂徕林蛙(细弱)、镇海林蛙(弱)、寒露林蛙(弱)和峨眉林蛙(不显)；趾端圆，趾端无沟，区别于威宁蛙的趾端吸盘小，具腹侧沟；后肢贴体前伸达眼至鼻孔之间，区别于徂徕林蛙、镇海林蛙、峨眉林蛙的后肢贴体前伸达鼻孔前方，威宁蛙的达鼻孔和吻端之间，寒露林蛙和昭觉林蛙的超过吻端。本次采集的大别山林蛙和模式产地标本在形态上也存在一些差异，桐梓的指长序为3>4>1≈2，大别山的为3>1>4>2。但本次样本数量有限，上述差异是否为适应不同的环境而导致的形态变异，还有待采集标本进行论证。

大别山林蛙为中国特有种，此前报道在我国的分布仅限于安徽岳西县鹞落坪自然保护区，海拔1 150 m 左右的山区(Wangetal.，2017)。此次在贵州省桐梓县黄莲自然保护区内(海拔 1 666 m)发现大别山林蛙，丰富了其分布信息，以及拓宽了对该物种分布海拔的认识。