浅谈标准物质/标准样品生产者实验室管理

陆莉峻 方 诚 王 刚 郑 琦

国药集团化学试剂有限公司（上海 200002）

中国加入WTO 之后，在国外检验检测企业的冲击之下，国内检测行业面临着巨大挑战，需要不断提升检测能力和质量管理体系水平。自从2000年原中国实验室国家认可委员会（CNAL）签署国际实验室认可合作组织（ILAC）多边互认协议之后，国内检测机构及实验室不断申请通过实验室能力认可，提升实验室检测能力，完善质量管理体系。同时，国家也不断地对认可文件进行完善。2006年，成立中国国家合格评定委员会（CNAS）代替CNAL 继续保持我国认可机构在ILAC 中实验室认可多边互认协议方中的地位。

根据CNAS 官方数据统计，截止到2020年9 月30 日，已获CNAS 认可的检验检测实验室11 089家，涉及检测、校准、医学、生物安全、标准物质生产者、能力验证提供者、实验动物机构、科研等领域。但是，通过标准物质/标准样品（RM）生产者能力认可的只有21家。由此可见，RM 生产者能力认可的数量远远满足不了现在国内行业的需求。

1 RM 生产者能力认可的基础

RM 生产者的基础是实验室必须具备一定的检验检测能力，其评价准则是CNAS-CL01:2018《检测和校准实验室能力认可准则》[1]，对实验室检测涉及的“人、机、料、法、环”5 个方面进行规定[2]，条款细化到检测工作的各个方面，包括工作流程、岗位职责、技术要求等。根据该准则建立的实验室管理体系，具有文件化、具体化、规范化、模式化等特点，配合内审、管理评审、外审等监管措施，可将检测工作中的风险因素降至最低。通过CNAS-CL01 能力认可的实验室，其检测技术能力和检测相关的质量管理体系，已经可以基本满足RM 生产者实验室管理的基础要求[3]。在CNAS-CL04:2017《标准物质/标准样品生产者能力认可准则》[4]中，实验室检测部分的条款大部分以CNAS-CL01 为准，除此之外，还规定了原材料、包装、均匀性和稳定性、定值、数据分析等几个关键环节的要求。

2 RM 生产者实验室管理的关键环节

2.1 原材料

由于RM 的原材料直接影响其特性值，所以要求对原材料制定相应的管理程序，以保证后期特性值的准确和稳定。首先，对原材料的供应商选择进行管理。对原材料供应商的质量水平和生产工艺进行调研，确定其管理体系和技术水平是否符合RM 生产需要，并且能够保证长期稳定地提供一定数量的原料。对合格的供应商进行汇总，制定合格供应商名录以及供应商考评机制，定期对合格供应商进行评价[5]。

其次，制定原材料验收标准。验收标准需要综合考虑标准物质的性质、纯度、可能存在的杂质以及特性值的应用范围。验收标准中，纯度通常是最主要的验收指标。纯度限度范围往往依赖于预期或者官方用途：化学对照品含量测定用原料质量分数一般要求不低于99.5%；限度检查用原料质量分数一般要求不低于98%；非定量用原料，依具体品种情况确定。在少数情况下，可能出现原材料质量达不到预期要求，同时又没有其他合格供应商的情况，这时就需要对原料进行一定的处理，比如，使用两种或以上质量稳定的原料进行合成，采用物理、化学方法进行提纯或者去除目标杂质，在生物领域中还会用到培育等技术。在国际标准物质的研制中，如果出现样品质量不符要求而生产单位无精制能力，则由设在瑞典的国际化学品对照中心承担精制[6]。

对于已经验收完毕的合格原材料，必须有相应的监控措施，确保其在保存期间的质量不发生较大变化。对于保存时间较长的原材料，在配置RM 前需要再次进行检测，确保其纯度和特性指标符合要求。原材料在入库之前需要进行登记，贴上唯一性标识，确保每一批原材料信息的可追溯性。原材料在交接过程中必须有相应的交接记录，交接记录中不仅要有原材料的溯源信息，还应包括交接的环境条件，以便后期研究外部环境条件是否会对标准物质后期特性值带来不良影响。

2.2 包装

RM 包装是一个重要环节，包装后的成品需要保证其稳定性及特性值不被影响。在包装环节，包装容器的选择、包装过程中的操作、成品标签等需要通过制定相应的规范文件来控制[7]。不同的标准物质对于包装的要求也不同：固体标准物质主要使用西林瓶、螺口瓶和安瓿瓶，传统包装方法一般采用天平称量，在十万级净化环境条件下分装，对于易吸潮、易氧化的标准物质，分装时填充氮气或其他惰性气体。目前，在固体标准物质分装中已经开始使用自动化仪器——小型螺杆式无菌粉末分装机[8]。液体标准物质主要使用螺口瓶和安瓿瓶，一般工作试剂（标准滴定溶液、杂质标准溶液等）由于量比较大，所以使用螺口瓶；而一些纯品物质（对照品标准物质、高纯度液体标准物质）由于生产成本比较高，所以包装量都比较小，一般会用安瓿瓶，在包装过程中充入惰性气体后熔封。目前，液体标准物质的包装也有自动化仪器——液体蠕动泵（连续分装）和联动熔封机[9]。气体标准物质需要存储在耐高压的气瓶中，包装容器的材质通常为金属（一般为铝合金或铁瓶）[10]。由于化学性质的原因，某些气体会吸附在气瓶内壁上。在罐装时，如果是高含量的气体标准物质，气瓶内壁的吸附对于含量的影响几乎可以忽略，但是低含量的气体标准物质，罐装时需要进行预饱和处理。生物标准物质的分装必须在低湿度条件下进行，包装容器通常采用高压聚乙烯瓶，必要时还会外套高强度复合塑料膜真空包装，防止光照和空气的渗入。包装工艺也相对复杂，需要先进行冷冻干燥处理，一些特殊的标准物质还需要在真空下处理[11]。所有标准物质的标签必须保证信息完整、内容清晰，标签材质耐低温、耐高温、耐腐蚀性有机溶剂，防水性好，不易变形脱落。标签打印应按需定量，记录发放数量及领取时间，以便日后追溯；及时销毁作废的标签及剩余标签，避免混乱而导致贴错标签。

2.3 均匀性和稳定性评估

RM 的均匀性评估是为了检验RM 在最终包装之后，其特性值是否均在规定的不确定度范围内，以此来保证RM 的特性值是均匀的。不论制备过程中是否经过均匀性初检，凡成批制备并分装成小包单元的标准物质必须进行均匀性检验。对于分级分装的标准物质，凡由大包装分装成小包装单元时，都需要进行均匀性检验[12]。在做RM 均匀性实验时，对于最小取样量的确定至关重要。根据特性值的检测方法以及购买RM 用户的使用需求，综合确定最小取样量。对于通过均匀性评定的RM，取样量越小，说明RM 的特性值越均匀。取样的单元数取决于批的大小，随机抽取的最小瓶数在10～30 之间，而且一般不低于10 瓶。均匀性检验的数据还应量化，需要满足一定的重复性要求，以减小对标准值不确定度的贡献。如果RM 有多个特性值，则需要对每一个特性值分别进行均匀性评估。

RM 的稳定性评估主要分为两方面：RM 在规定的贮存条件下目标特性的稳定性，RM 在规定的运输条件下目标特性的稳定性。通过改变对RM 可能产生影响的环境贮存条件，如光照、温度、湿度等[13]，研究RM 会不会发生物理、化学、生物反应，同时通过分析RM 的特性值找出变化规律[14]。贮存条件的确定，需要通过长期的稳定性实验来评估。一般来说，长期稳定性实验的影响条件主要是贮存温度，所以，在设置温度点时，每个温度点下至少10～12 瓶，时间跨度可以持续1～2年，时间点一般为5～6 个。市场上RM 的有效期一般为1年。运输条件则需要考虑在运输过程中温度的变化对于RM 的影响，所以这一温度变化范围要比贮存的温度变化范围大。在运输条件的稳定性实验中，时间跨度一般为1～2个月，时间点的设置也是5～6 个，每个温度点下需要6～10 瓶。在确定运输条件后，需要拟定包装说明，编制客户运输作业指导书，以降低风险因素。研究运输条件影响时还可以使用加速稳定性实验，即通过研究RM 在极端温度下其目标特性值的变化情况来推测运输条件的临界值。

2.4 定值

RM 的定值首先需要确定其特性，是定量还是定性；如果是定量特性，那对特性的定值需要证明溯源性，即标准物质的量值能通过连续的比较链以给定的不确定度与国家或国际基准联系起来。对于实验结果的溯源性，在CNAS-CL01 中已有相关要求，主要是要求所有涉及检测结果计算的测量仪器都需要由具有资质的检测校准机构进行校准，并且需要提供校准结果及其不确定度。定值不确定度评定需要考虑定值过程中的影响、单元间的实际差异，以及定值随时间和运输贮存过程变化的影响。

2.5 数据分析

RM 的数据分析，主要分为5 个阶段。

第一阶段：筛查岐离值。在每一次评估数据测定完毕后，需要去除岐离值，采用Grubbs 法或Dixon法[15]。

第二阶段：对数据进行正态分布检验。正态分布检验中最直观的是图检验，如频率直方图、QQ 图等；但是图检验之后，一般还需要结合规范性检验方法，常见的有偏锋检验法、夏皮罗·威尔克（Shapiro·Wilk）法（W 检验法）、达戈斯提诺（D’Agostoon）法（D检验法）、爱泼斯·普利（Epps·Pulley）法等[16]。W 检验法适用于数据量在100 以内的情况[17]，D 检验法适用于数据量为50～1 000[18]的情况，爱泼斯·普利法则适用于数据量大于8 的情况[19]。

第三阶段：均匀性评估。均匀性评估需要分别评估单元间均匀性和单元内均匀性。常用的检验方式有ANOVA 方式和替代方式[20]。ANOVA 方式就是方差分析方式，又称“变异系数分析”或者F 检验法，用于两个及两个以上样本均数差别的显著性检验。计算时通过方差分析得出F 检验值，将其与所选择的置信概率下的临界值进行比较，最终得到均匀性评估结论。替代方式虽然可以减少测量次数，但是其统计可靠性相对较低，所以现在很少被使用。

第四阶段：稳定性评估数据处理。一般情况下会选择单一保存条件下的多时间点测量数据，使用直线拟合法（即线性模型）记录拟合曲线斜率与截距，使用t 检验法，判断斜率与零是否有显著性差异。目前有一些新的实例，在稳定性评估过程中，通过极差质控图和均值质控图，结合线性回归的结果，能直观地发现异常值，对异常值的检测更加灵敏[21]。

第五阶段：标准物质定值。为标准物质定值的方式有多种，一是单一实验室采用单一基准方法定值，二是单一实验室采用两种或多种不同原理的独立参考方法定值，三是多家实验室使用一种或多种已证明准确性的方法合作定值，四是利用特定方法定值，五是利用一级标准物质进行比较定值。其中,基准方法具有国家最高计量学品质，能够确保测量的有效性，在标准物质定值中具有重要地位。1998年，化学计量物质的量咨询委员会（CCQM）第四次会议在法国巴黎召开,此次会议对基准方法进行了如下定义:基准方法是具有最高计量品质的方法，其操作可以被完全地描述和理解，其不确定度可以用国际单位表述[22]。目前，单一实验室采用单一基准方法或者联合多家实验室用单一基准方法进行定值的方式较为普遍。

3 结语

标准物质的整个研制过程可以概括为原材料制备、成品包装、分析检测、均匀性和稳定性评估、定值。其中：分析检测依据CNAS-CL01 的要求进行；其他各个关键环节均需达到CNAS-CL04 的要求，原料纯度越高越好；产品包装需要根据不同标准物质的物理化学特性，保证标准物质不会因与包装容器发生反应而失效；均匀性和稳定性评估都是以数理统计的方法，证明标准物质在规定的使用条件下，其特性值能保持均匀、稳定，不受外界客观条件的影响；定值则是根据制定的实验方案及定值方式，将所得结果进行合并，给标准物质进行定值。通过分析，标准物质的研制过程就直观很多，只要一个个环节去攻克，同时制定相应的文件进行严格管理，就能很好地实现标准物质生产过程细致且规范的管理，也就能达到CNAS-CL04 的要求，将实验室的管理及技术能力提升一个层次。

中国与国际合作交流日益加强，对国内实验室的要求也不断提高。对于实验室的发展来说，CNAS-CL01 是基础，CNAS-CL04 是目标，通过标准物质的研制生产，赋予产品技术高附加值，才能真正做到技术发展。近年来，各行各业对标准物质品种和数量的需求不断增加，这对国内标准物质的研制生产是一个重大机遇。一旦真正掌握一种标准物质的研制生产，开发其他同类型的标准物质就会相对轻松，至少在生产管理方面没有太多问题，这也是企业发展核心竞争力、打造高质量发展的重要途径之一。