基于网络药理学和分子对接技术的黄芪赤风汤在化湿败毒方治疗新型冠状病毒肺炎中的作用

崔连杰,李 科,秦雪梅,李震宇,杜昱光,王盛金

(1山西大学中医药现代研究中心,太原 030006;2山西大学化学化工学院;3中国科学院过程工程研究所;4陵川县农业综合开发中心;*通讯作者,E-mail:like@sxu.edu.cn)

新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)目前在全球蔓延,我国疫情已基本稳定,中医药在此次疫情防控表现出其特色优势,在参与全国救治确诊病例中占比达91.5%,在湖北省确诊病例中使用率和总有效率超过90%[1]。中医药通过临床筛选出的“三药三方”在针对新冠肺炎的不同症状治疗中发挥了重要的作用,其中化湿败毒方是由经典名方麻杏石甘汤、宣白承气汤、达原饮、藿香正气散、桃仁承气汤、葶苈大枣泻肺汤、黄芪赤风汤和玉屏风散化裁而来,已有研究表明[2,3],化湿败毒方主要是通过调控机体的免疫和炎症相关通路来治疗COVID-19,是多成分、多靶点、多途径作用的结果。本文将着重对黄芪赤风汤在该方中产生的作用进行研究,黄芪赤风汤出自《医林改错》,由黄芪、赤芍、防风三味药组成,其中黄芪益气扶正,赤芍行瘀,防风解毒,黄芪赤风汤具有补气扶正、调理气血功效,对提高人体免疫力起到重要作用。新冠肺炎治疗过程中发现免疫力差的人更容易患病,病情也较重,免疫力强的人即使患病后也多为轻症,因此自身免疫力和抵抗力的提高是防治新冠肺炎最重要的一环,中医理论称之为“正气存内,邪不可干”,以扶助人体正气为主,可促进患者恢复。因此,本文将对黄芪赤风汤发挥作用的活性成分和作用机制进行研究,阐明其在化湿败毒方治疗COVID-19中发挥的作用,丰富中医药治疗COVID-19的理论依据。

中药方剂具有多成分、多靶点、多通道、多环节的特点,具体活性成分和活性成分间的相互作用关系难以确定,而网络药理学基于系统生物学、生物信息学和高通量组织学,可以将网络生物学与药理学相结合,直接从大量数据中识别药物和疾病靶标,并展现它们之间的相互关系和作用机制,因此网络药理学成为研究中药方剂物质基础和作用机制的有效手段[4]。分子对接技术作为一种辅助筛选手段,在中药药效物质、寻找药物作用靶点、探索中药作用机制方面广泛运用,网络药理学结合分子对接技术应用于中药活性基础研究具有显著的优势[5]。因此本文通过网络药理学对黄芪赤风汤中核心活性成分及其作用靶标进行筛选,预测其治疗COVID-19可能的生物途径,并通过分子对接技术对方剂中主要成分与COVID-19疾病相关靶点进行分子对接,阐明黄芪赤风汤药效的作用机制。

1 方法

1.1 黄芪赤风汤中活性成分筛选及作用靶点的收集

借助TCMSP数据库(http://tcmspw.com/index.php),以“黄芪”“赤芍”“防风”为关键词搜索黄芪赤风汤中的化合物成分。口服生物利用度(oral bioavailability,OB)是药物通过口服方式进入体循环发挥药效的重要指示参数,类药性(drug likeness,DL)是化合物表现出来的理化性质和结构特征等与已知药物的相似度。通常认为中药中OB≥30%和DL≥0.18的化学成分为活性成分[6,7]。以OB≥30%和DL≥0.18筛选黄芪赤风汤中活性成分,并通过在TCMSP数据库收集所有活性成分作用靶点,在线数据库Uniprot(https://www.uniprot.org/)收集活性成分作用靶点的对应基因名,构建药物作用靶点库。

1.2 中药—活性成分—靶点网络的构建

将黄芪赤风汤中收集整理好的中药,活性成分,对应靶点基因导入Cytoscape 3.6.0软件,构建中药—活性成分—靶点网络。对三味中药活性成分靶点取交集,得出黄芪赤风汤体内作用的重要靶点。

1.3 COVID-19疾病靶点筛选

通过在线GeneCards数据库(https://www.genecards.org/),以“novel coronavirus pneumonia”、“fatigue”、“dry cough”“fever”检索与COVID-19疾病相关靶点基因,汇总后去重,其中基因打分值越高表明与疾病的相关性越强,筛选打分值靠前基因,构建疾病靶点库。

1.4 药物作用靶点和疾病相关靶点交集

通过Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html),将黄芪赤风汤作用靶点和COVID-19疾病靶点基因取交集,根据Venn图得出黄芪赤风汤产生药效的所有作用靶点。

1.5 核心靶点筛选

将药物作用靶点和疾病相关靶点的交集导入String在线数据库(https://string-db.org/),构建蛋白质相互作用(PPI)网络,代表靶点蛋白间的关联度,PPI网络信息导入Cytoscape3.6.0构建可视化模型,根据靶点节点大小,连线数量与粗细,筛选出黄芪赤风汤的核心作用靶点。

1.6 黄芪赤风汤靶点通路分析

将黄芪赤风汤中产生药效的所有作用靶点基因导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)进行GO生物学过程富集分析和KEGG信号通路富集分析,基因名称物种限定为人,筛选P值小于0.05,选取前20个条目可视化处理,分别绘制成柱状图和气泡图。

1.7 分子对接研究

选取中药—活性成分—靶点网络中拓扑值较高的前15个药效成分,下载其sdf格式的结构文件,从PDB数据库(http://www.rcsb.org/)下载SARS-CoV-2 3CL水解酶(6LU7)和血管紧张素转化酶Ⅱ(ACE2)pdb格式文件,通过软件SYBYL2.0,移除靶蛋白上水分子,提取配体,并进行残基修饰、加氢、优化蛋白等操作后,与黄芪赤风汤中活性成分结构进行分子对接,根据打分值进行评价。

2 结果

2.1 黄芪赤风汤活性成分筛选结果

黄芪赤风汤由黄芪、赤芍和防风组成,经TCMSP检索到黄芪赤风汤中的化合物共379个,其中黄芪甘,微温,归脾肺经,为补脾肺气要药,包含87个化学成分;赤芍苦,微寒,归肝经,可治肺邪气,包含119个化学成分;防风甘辛,微温,归肝脾膀胱经,有祛风解表功效,包含173个化学成分。经OB≥30%和DL≥0.18筛选后,黄芪赤风汤满足条件的活性成分共49个(见表1),其中黄芪包含17个,赤芍包含14个,防风包含18个。

表1 黄芪赤风汤中活性成分的基本信息 (未完待续)

续表1 黄芪赤风汤中活性成分的基本信息

2.2 中药—活性成分—靶点网络的构建

根据筛选到的黄芪赤风汤中活性成分,收集每个成分的作用靶点构建中药—化合物—靶点网络(见图1),其中包含3个中药,49个化合物,232个靶点,网络图中自由度值排名前15的化合物分别是:槲皮素、山柰酚、汉黄芩素、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇、黄芩素、刺芒柄花素、异鼠李素、豆甾醇、3,9-二-O-甲基尼森香豌豆紫檀酚、5-O-甲维阿斯米醇、常春藤皂苷元、黄芪紫檀烷、鞣花酸、毛蕊异黄酮、黄花菜木脂素A,它们可作用靶点数分别为145,59,44,42,36,35,32,28,23,23,22,22,21,19,18个;网络图中自由度值排名前15的靶点分别是:PTGS1、PTGS2、DPP4、AR、PRSSI、GABRA1、NOS2、ESR1、RXRA、SCN5A、CHRM1、ADRB2、PGR、HSP90AB1、PDE3A,分别有34,21,21,20,16,16,16,16,15,14,13,12,12,11,11个化合物共同作用于这些靶点。对黄芪、赤芍、防风中活性成分作用靶点取交集,三味药共同作用靶点有54个(见图2)。这些自由度较高的成分与靶点以及三味药共同作用靶点数说明黄芪赤风汤可能通过多成分、多靶点间相互协同作用在治疗新冠肺炎中起作用。

图1 黄芪赤风汤中药—活性成分—靶点网络Figure 1 Chinese medicine-compound-target network of Huangqi Chifeng decoction

图2 黄芪赤风汤中三味中药共同作用靶点Veen图Figure 2 Veen diagram of the targets of Chinese medicines in Huangqi Chifeng decoction

2.3 黄芪赤风汤活性成分靶点与COVID-19疾病靶点的交集

黄芪赤风汤232个活性成分靶点与COVID-19疾病1 158个相关的靶点取交集得到共同靶点105个(见图3)。将共同靶点导入STRING数据库,得到PPI蛋白相互作用网络,其中包含105个靶点蛋白,1 986条靶点蛋白间连线,平均度值为37.8,用Cytoscape3.6.0软件将PPI蛋白互作网络进一步可视化处理(见图4),其中节点颜色越深、连线越多说明该节点对应的靶点蛋白与其他蛋白关联程度越高,该靶点蛋白越重要。其中自由度排名前20的靶点有:IL-6、TNF、VEGFA、AKT1、MMP-9、CASP3、TP53、CXCL8、CCL2、PTGS2、EGF、IL-1B、IL-10、FN1、MAPK1、MMP-2,IL-4、MYC、EGFR、ICAM-1,度值分别为64,64,62,61,56,55,55,55,54,54,53,53,53,53,51,51,49,49,48,47。药物与疾病交集得到105个靶点均为黄芪赤风汤药效靶点,其中度值排名越靠前的靶点蛋白表明其越重要,可能是黄芪赤风汤治疗COVID-19疾病的核心靶点。

图3 黄芪赤风汤与COVID-19疾病相关靶点Veen图Figure 3 Veen diagram of targets of Huangqi Chifeng decoction and COVID-19 disease

2.4 黄芪赤风汤靶点通路分析

对黄芪赤风汤中105个药效靶点在DAVID数据库中进行GO功能富集分析,按P≤0.05筛选得到GO条目共528条,生物过程(BP)有424条,细胞组成(CC)有43条,分子功能(MF)有61条,排名前20见图5。KEGG通路富集分析得到105条信号通路(P≤0.05),其中肺结核(tuberculosis)、百日咳(pertussis)、乙型肝炎(hepatitis B)、甲型流感(influenza A)、小细胞肺癌(small cell lung cancer)、NOD样受体信号通路(NOD-like receptor signaling pathway)和Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)等与肺部炎症、肺部感染和肺损伤保护相关,其中肺结核相关基因有IL-6、TNF、RAF1、STAT1、IL-10、TGFB1等;百日咳相关基因有IL-6、TNF、CXCL8、IL-10、MAPK1、FOS等;乙型肝炎相关基因有IL-6、TNF、MMP-9、TP53、CXCL8、RAF1等;甲型流感相关基因有ICAM-1、IL-6、TNF、CCL2、PRSS1、CXCL8等;小细胞肺癌相关基因有AKT1、CCND1、CASP9、PTGS2、BCL2、TP53等;NOD样受体信号通路相关基因有MAPK1、IL-6、TNF、HSP90AA1、CCL2、MAPK14等;Toll样受体相关基因有IL-6、TNF、CXCL8、NFKBIA、STAT1、CXCL10、AKT1、MAPK1、FOS、MAPK14、JUN、CASP8、IL-1B、MAPK8、LBP、CD14、SPP1等,排名前20见图5。

图4 黄芪赤风汤与COVID-19疾病共同靶点的PPI蛋白相互作用网络Figure 4 The Protein-protein interaction network of the common targets of Huangqi Chifeng decoction and COVID-19 disease

2.5 活性成分与SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2分子对接结果

SARS-CoV-2 3CL水解酶在病毒生命周期中发挥重要作用,COVID-19病毒以血管紧张素转化酶2作为受体侵入细胞导致肺损伤,因此认为SARS-CoV-2 3CL水解酶和血管紧张素转化酶Ⅱ(ACE2)可作为治疗COVID-19病毒的两个有效靶点。分子对接是通过几何匹配和能量匹配找到分子与靶点蛋白之间最佳匹配模式的过程,在SYBYL2.0软件的Dock系统中,一般认为打分值越大,结合越稳定,打分值>4.25说明分子与靶点有一定的结合活性,打分值>5.0说明结合活性较好,打分值>7.0说明有强烈的结合活性[8]。利用SYBYL2.0软件对中药—活性成分—靶点网络中自由度较大的前15个化合物进行分子对接,模拟分子20种构象与靶蛋白相互识别,找到最佳匹配模式并得出分值,黄芪赤风汤中连接靶点较多的前15个化合物中,有5个与SARS-CoV-2 3CL水解酶有一定结合活性,分别为:3,9-二-O-甲基尼森香豌豆紫檀酚、黄花菜木脂素A、豆甾醇、异鼠李素、毛蕊异黄酮(见表2);有8个与ACE2有一定结合活性,其中5个结合活性较好,分别为:槲皮素、异鼠李素、5-O-甲维阿斯米醇、常春藤皂苷元、黄花菜木脂素A、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇、豆甾醇、毛蕊异黄酮(见表2)。根据分子对接打分值排名前五的化合物与靶点蛋白的结合模式(见图6),表明这些化合物可以通过氢键与靶蛋白上一个或多个氨基酸结合发挥作用。

图5 黄芪赤风汤中药效靶点GO富集分析和KEGG富集分析Figure 5 Analysis of GO enrichment and KEGG pathway enrichment of the key targets in Huangqi Chifeng decoction

表2 黄芪赤风汤中15个化合物分子对接打分值

图6 黄芪赤风汤中活性成分与ACE2和SARS-CoV-2 3CL水解酶分子对接模型Figure 6 Molecular docking model of SARS-CoV-2 3CL hydrolase and ACE2 with active compounds in Huangqi Chifeng decoction

3 讨论

COVID-19肺炎属于中医“疫”病范畴,病因为感受“疫戾”之气,疫病专著《温疫论》载“本气充满,邪不易入,本气适逢亏欠,呼吸之间,外邪因而乘之”,即认为瘟疫中戾气是疫病的外因,正气虚弱是发病的内因,中医对疫病治疗原则强调“扶正祛邪”[9],现代医学表明COVID-19为病毒性肺炎,对人体的多个重要脏器和免疫系统都造成损害,愈后的关键因素取决于人的免疫力,这与中医理论不谋而合。黄芪赤风汤中黄芪益气补虚,防风祛风壮气,增强黄芪补气之功效,赤芍凉血活血,与黄芪相配补气行血[10],现代药理研究表明黄芪能双向调节免疫、抗氧化[11],赤芍能抗炎、抗氧化[12],防风能抗炎、解热[13]。因此推测黄芪赤风汤在化湿败毒方治疗COVID-19病毒性肺炎过程中主要作用是提高机体免疫力,同时减轻炎症损伤,促进机体恢复。

黄芪赤风汤的活性成分—靶点网络显示PTGS1、PTGS2、DPP4、AR、PRSSI、GABRA1、NOS2、ESR1、RXRA、SCN5A具有较高度值,其中PTGS1和PTGS2主要参与炎症反应,PTGS1通过参与合成前列腺素(PG),调节肾脏,胃肠和血小板功能,PTGS2可被生长因子、炎性细胞因子和肿瘤启动子迅速诱导,合成细胞中的PG,主要参与局部和全身炎症反应[14]。DPP4是一种T细胞表面抗原,在维持免疫淋巴细胞组成和功能、T细胞共刺激和记忆性T细胞生成方面起着重要作用[15]。AR可以影响细胞因子和细胞免疫,表现出抗炎反应[16]。NOS2参与炎症,增强促炎介质如IL-6和IL-8的合成[17]。ESR1可以影响靶组织中的细胞增殖和分化,还可以与NF-κB协同作用,激活涉及机体防御反应、组织损伤和应激、细胞分化和凋亡以及肿瘤生长抑制过程的信息传递[18];RXRA在对病毒感染导致的免疫力下降中发挥作用,可能通过负调控抗病毒基因(例如I型IFN基因)的转录来实现[19],这表明黄芪赤风汤中度值较高的靶点基因与冠状病毒导致肺组织损伤引发的加重炎症反应和过度免疫细胞激活有关,可能通过调节免疫力改善炎症反应的方式来发挥作用。PPI蛋白互作网络中度值较高的靶点基因有IL-6、TNF、VEGFA、AKT1、MMP-9、CASP3、TP53、CXCL8、CCL2、PTGS2、EGF、IL-1B、IL-10、FN1、MAPK1、MMP-2,IL-4、MYC、EGFR、ICAM-1,其中IL-6、IL-1B、IL-10和IL-4在炎症和各种免疫细胞中均起不同程度的调节作用,基质金属蛋白酶MMP-9和MMP-2可以影响凋亡趋化因子和细胞信号转导因子,这些因子会影响免疫反应[20]。MAPK1可影响细胞生长、分化和凋亡,还可以诱导炎症反应[21];AKT1与呼吸道炎症性疾病的治疗有关,AAK1的破坏还可以中断病毒进入细胞的通道以及病毒颗粒在细胞内的组装[22,23];TNF与巨噬细胞/单核细胞在急性炎症过程中产生炎症细胞因子有关,在抵抗感染和癌症中起作用[24]。核心靶点基因富集到的通路有肺结核、乙型肝炎、甲型流感、小细胞肺癌、NOD样受体信号通路和Toll样受体信号通路等均与肺部炎症感染和免疫损伤保护有关,这进一步表明黄芪赤风汤是通过多成分、多靶点、多通道对COVID-19病毒性肺炎造成的炎症感染和免疫降低产生作用。SARS-CoV-2 3CL水解酶在病毒生命周期中发挥重要作用[25],COVID-19病毒以血管紧张素转化酶2作为受体侵入细胞导致肺损伤[22],因此选择活性成分—靶点网络中度值高的化合物与两种酶进行分子对接,其中的槲皮素、异鼠李素、豆甾醇、黄花菜木脂素A、毛蕊异黄酮、5-O-甲维阿斯米醇等成分对血管紧张素转化酶Ⅱ和SARS-CoV-2 3CL水解酶均显示出良好的结合活性,进一步说明黄芪赤风汤对COVID-19病毒性肺炎有一定作用。

综上,本文通过网络药理学与分子对接技术,对黄芪赤风汤在化湿败毒方治疗新型冠状病毒肺炎(COVID-19)中的作用进行了研究,化湿败毒方治疗新冠肺炎有两个特点,一是消灭病毒,二是增强自身免疫力。研究表明黄芪赤风汤主要功能是通过方剂中多个活性成分,如槲皮素、异鼠李素、豆甾醇、黄花菜木脂素A、毛蕊异黄酮、5-O-甲维阿斯米醇等,作用于多个靶点,影响免疫和炎症相关通路,发挥消除炎症,提高免疫力的作用,进一步丰富了中医药治疗COVID-19的理论依据。