清香型志都五谷酒关键香气成分分析

杜静怡，朱婷婷，黄明泉，魏金旺,*，吴继红，张璟林，王 娟

（1.食品质量与安全北京实验室，北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京市食品风味化学重点实验室，北京工商大学，北京 100048；2.北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂，北京 101301）

酒的酿造工艺可以追溯到2 000年以前，是人类最早掌握的发酵技术之一[1]。白酒是中国的国酒，是一种用谷物发酵制取的传统蒸馏酒。丰富而具有特色的酿造工艺和地理环境、不同呈香物质含量及其比例使中国白酒品种众多，香型特色各不相同[2-4]。目前已经形成了十二大代表香型白酒，分别为浓香型、酱香型、清香型、米香型、药香型、兼香型、凤香型、特香型、馥郁香型、芝麻香型和老白干香型白酒[5]。清香型白酒因其悠久的历史和入口绵、落口甜、香气清正的独特风味长期以来受到消费者的喜爱，曾经在全国的市场占有率达到75%以上[6]，目前清香型白酒仍然占有很大的比例。清香型白酒主要的代表产品有山西汾酒、衡水老白干、北京牛栏山二锅头、河南宝丰酒、青稞酒、河南龙兴酒和浙江同山烧等，多数为北方地区生产。而小曲清香型白酒是一种固态、半固态发酵法白酒，适宜在亚热带气候条件下生产，主要分布在我国西南部省区。

小曲清香型白酒使用整粒原料，采用纯种根霉和酵母菌，具有用曲量小、发酵周期短及出酒率高等特点[7-8]。各产地酿造工艺略有不同，经过长期实践，云南小曲清香白酒形成了其特有的工艺规程，如图1所示，与川法清香小曲酒的用曲量、用曲次数、发酵罐、发酵时长及培菌工艺有明显差别[9]。

图1 云南小曲清香型白酒酿造工艺Fig. 1 Flow chart illustrating the brewing process of Yunnan Xiaoqu light-flavor Baijiu

目前对于白酒的研究主要集中于微生物[10-11]、风味成分[12-13]、酿造工艺[14-15]和健康因子[16-17]等方面。清香型白酒的研究也同样体现在功能微生物[18-22]及风味成分分析[23-25]等方面。这主要是因为白酒发酵过程各阶段微生物的生长代谢活动对白酒风味物质的形成具有重要影响；而在风味成分分析方面，研究者聚焦于白酒风味全分析，以期找到不同香气香型白酒中关键香气活性物质而达到指导实际生产的目的，常用的方法为风味组学分析技术[26-27]。即通过多种前处理方式将待分析成分与基质分离，再通过仪器进行分离分析定性，结合嗅闻分析和感官实验对香气活性化合物进行筛选，再对这些香气活性成分进行定量分析并计算香气活性值（odor activity value，OAV），将OAV大于1的香气成分进行重组缺失验证实验，从而找到白酒关键香气活性成分。

丁云连[23]通过使用浸入式固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用仪定性定量分析了汾酒中香气活性物质，结合气相色谱-嗅闻（gas chromatography-olfactometry，GC-O）联用仪初步确定了苯乙醛、4-乙基愈创木酚、苯乙酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯、β-苯乙醇、辛酸乙酯、乙酸乙酯、3-甲基丁醇、2-甲基丙醇和1-辛醇这10 种香气物质为汾酒的特征香气物质。Gao Wenjun等[28]通过GC-O动态强度法结合质谱仪在汾酒、宝丰酒、青稞酒3 种清香型白酒中共鉴定出66 种香气活性化合物，将27 种OAV不小于1的香气物质进行重组实验，成功模拟出清香型白酒的香气特征；通过缺失实验进一步证明具有花香、蜂蜜味的β-大马酮和乙酸乙酯对清香型白酒的香味有重要贡献。Yang Jiangang等[29]以4 种四川小曲清香型白酒为对象，通过直接进样结合气相色谱仪定量分析了丙醇、乙酸乙酯、异丁醇、异戊醇和乳酸乙酯，其中异戊醇和正丙醇在4 个样品中比率为1.0～1.5，异戊醇和异丁醇的比率分别为1.8～2.5，同时提出四川小曲清香型白酒中较大的杂醇油占比和互相之间的特殊比例关系可能是四川小曲酒的标志。

总体上，目前针对清香型白酒的研究中有北多南少的现象，清香型白酒各种品类香气成分研究还不够全面，且未有综合运用感官组学方法分析小曲清香型白酒关键香气活性化合物的研究。

本实验通过直接进样、顶空-SPME和液液萃取提取分离云南志都五谷小曲清香型白酒中的香气成分，通过GC-O与香气提取稀释分析方法找出其香气活性化合物；然后采用气相色谱-氢火焰离子检测器（gas chromatography-flame ionization detector，GC-FID）和GC-MS联用仪对重要的香气活性化合物进行定量并计算OAV；进一步将OAV大于1的物质建立重组模型；最终结合香气提取稀释分析、OAV以及重组实验的结果确定志都五谷白酒中的关键风味物质。本研究揭示了地区小曲清香型白酒的主要香气组成，可为小曲清香型白酒的质量控制提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

云南志都五谷小曲清香型白酒成品酒（乙醇体积分数53%），于2018年6月17日取自云南志都五谷酒有限公司。

正构烷烃混合标准品（C7～C27）、内标为乙酸肉桂酯（IS1，纯度99%）、4-庚醇（IS2，纯度99%）、2-甲基己酸（IS3，纯度99%） 美国Sigma-Aldrich公司；二氯甲烷、无水乙醇、NaCl（均为分析纯） 国药集团（上海）化学试剂有限公司。

标准品（除标注外纯度均大于98%，色谱级）：乙酸乙酯、异丁酸乙酯、乙酸异戊酯、正丁醇、2-甲基丁醇、3-甲基丁醇、乳酸乙酯、乙酸、辛酸乙酯、3-羟基丁酸乙酯、异丁酸、癸酸乙酯、苯乙酮、3-甲硫基丙醇、十一酸乙酯、己酸、月桂酸乙酯、苯甲醇、2-苯乙醇、棕榈酸甲酯和硬脂酸乙酯 北京百灵威科技有限公司；3-甲基-2-丁烯-1-醇、2-羟基正丁酸乙酯（纯度95%）、糠醛、丁酸、愈创木酚、3-苯丙酸乙酯、辛酸 梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；正丙醇、异丁醇德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 仪器与设备

Trace 1300 ISQ GC-MS联用仪 美国赛默飞世尔科技公司；7890-5975GC-MS联用仪、DB-FFAP色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）、DB-WAX色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国Agilent公司；ODP3嗅闻检测仪 德国Gerstel公司；SPME手动进样手柄 上海安谱科学仪器有限公司；碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（carboxen/polydimethylsiloxane，CAR/PDMS）萃取头 美国Sigma-Aldrich公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限公司；RE-52旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 液液萃取[12]

取酒样（50.0 mL）用煮沸的超纯水稀释至10%乙醇溶液，添加110 g NaCl使其达到饱和；随后用重蒸的二氯甲烷（每次50 mL）萃取3 次，合并有机相；然后将其分为中/碱相（neutral/basic fraction，NBF）和酸相（acidic fraction，AF）。

有机相（约150 mL）先用Na2CO3溶液（0.50 mol/L，pH 10.0）萃取3 次（每次50 mL），合并有机相，再用饱和NaCl溶液（50 mL）洗涤有机相得到NBF组分；合并的水相（约200 mL）用HCl溶液（4.0 mol/L）调到pH 2.0，再用二氯甲烷萃取3 次（每次70 mL），合并有机相得到AF组分；NBF和AF组分都加入无水硫酸钠干燥过夜，再过滤，然后各自用旋转蒸发器和氮吹仪浓缩至500 μL，在-20 ℃贮存待分析。

1.3.2 SPME[30]

酒样用去离子水稀释至乙醇体积分数为10%溶液，吸取8.0 mL置于20 mL的顶空瓶中，加3 g NaCl使其达到饱和，加入10.0 μL内标IS1、IS2和IS3（最终质量浓度均为50.0 mg/L），旋紧瓶盖，插入SPME萃取头（PDMS）45 ℃平衡30 min，吸附萃取40 min，萃取过程保持振荡，萃取结束后在GC进样口（250 ℃）解吸5 min分析。

1.3.3 仪器分析条件

GC-MS 条件：DB - FFAP 石 英 毛 细 柱（60 m×0.25 mm，0.25 µm）；升温程序：初始温度40 ℃，以10 ℃/min升至50 ℃，保持3 min，再以3 ℃/min升至80 ℃，保持3 min，最后以6 ℃/min升至240 ℃，保持3 min；载气（He，99.999%）流速1.5 mL/min，进样量1.0 µL；液体进样分流比为20∶1，SPME不分流进样；电子电离源；电子能量70 eV；传输线温度230 ℃；离子源温度230 ℃；质量扫描范围m/z 30～500。

GC -MS -O 条件：DB - WAX 石 英 毛 细 柱（60 m×0.25 mm，0.25 µm）；升温程序：初始温度40 ℃，以10 ℃/min升至50 ℃，保持3 min，再以3 ℃/min升至80 ℃，保持3 min，最后以6 ℃/min升至245 ℃，保持5 min；载气（He，99.999%）流速1.5 mL/min，进样量1.0 µL；不分流进样。

FID定量条件：DB-FFAP色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：初始温度60 ℃，保持3 min，以10 ℃/min升温至70 ℃，保持1 min，然后以6 ℃/min升温至150 ℃，最后以20 ℃/min升至220 ℃，保持2 min；载气（N2，99.999%）流速1.0 mL/min，进样量1.0 µL；进样分流比为30∶1，进样口温度240 ℃，检测器温度240 ℃。

1.3.4 香气提取稀释分析

用配有嗅觉探测器（ODP3）和DB-WAX色谱柱的7890-5975 GC-MS联用仪进行香气组分的GC-O分析，色谱柱末端流量的一半进入质谱检测器，而另一半则进入嗅觉探测器。嗅觉测定由3 名小组成员（2 名女性和1 名男性，平均年龄24 岁，均来自某大学白酒风味化学课题组）进行。实验前，小组成员参加GC-O嗅闻实验训练2 个月，使用超过30 种香气化合物，浓度比空气阈值高10 倍。

将液液萃取得到的NBF和AF浓缩相分别通过如下梯度稀释进样嗅闻：4∶1、16∶1、64∶1、256∶1、1 024∶1、4 096∶1。小组成员将鼻子靠近嗅闻端口，记录香气和保留时间，每人重复3 次。香气稀释（flavor dilution，FD）因子为每种香气化合物能被3 个人同时闻到的最高稀释比。

1.3.5 定性分析

通过将化合物的香气、质谱碎片、保留指数（retention index，RI）与参考文献对比，再进一步使用标准品对比实现香气化合物的鉴定。DB-FFAP和DB-WAX柱的RI由正构烷烃（C7～C27）保留时间按下式计算：

式中：n和n+1分别为未知化合物流出前后正构烷烃碳原子数；t为未知化合物保留时间/min；tn和tn+1为相应正构烷烃的保留时间/min；tn＜t＜tn+1。

1.3.6 定量分析

1.3.6.1 高含量成分的定量分析

内标标准曲线法：对于一些高含量的化合物使用GC-FID定量，包括乙酸乙酯、正丙醇、2-甲基丁醇、3-甲基丁醇、乳酸乙酯、异丁醇、乙酸、辛酸乙酯、糠醛和2-苯乙醇。具体过程如下：

样品分析：在酒样中加入20.0 μL内标溶液（IS1、IS2和IS3）至最终质量浓度为200.0 mg/L，待进一步GC-FID分析。

标准曲线制备：以53%乙醇溶液为溶剂，制备相应的储备液，然后将储备液稀释，制备出一系列质量浓度（3 000.0、1 500.0、750.0、375.0、187.5、93.8、46.9、23.4、11.7 mg/L）标准品混合溶液，加入最终质量浓度为200.0 mg/L内标（IS1、IS2和IS3），分析条件与样品相同。

1.3.6.2 低含量成分的定量分析

内标标准曲线法：对于其他化合物（编号2、6、7、12、14、19、21、22、23、24、26、28、29、30、31、32、33、35、38、40）根据半定量分为2 组，使用GC-MS定量。具体过程如下：

样品分析：将50.0 mL酒样稀释至10%乙醇溶液，加入20.0 μL内标溶液（IS1、IS2和IS3）至最终质量浓度为50.0 mg/L并用NaCl饱和，二氯甲烷（每次50.0 mL）萃取3 次，合并有机相。加无水硫酸钠过夜。使用旋转蒸发器和氮吹仪浓缩至500 μL。待GC-MS分析。

标准曲线制备：以53%乙醇溶液为溶剂，制备2 组一系列质量浓度（50.0、25.0、12.5、6.3、3.1、1.6、0.8 mg/L和10.0、5.0、1.5、0.5、0.2、0.1 mg/L）标准品混合溶液，加入最终质量浓度为50.0 mg/L内标（IS1、IS2和IS3），分析条件与样品相同。

以3 倍信噪比为标准，将标准曲线的最低质量浓度稀释后进行分析，以获得香气化合物的检测限。以上所有分析重复3 次。

1.3.6.3 回收率测定

将30 种定量化合物配制到53%乙醇溶液中至最终质量浓度为5.0、30.0、100.0 mg/L的3 个样品，各取50.0 mL按1.3.6.2节标准曲线制备中的样品分析方法处理，然后将1.0 μL浓缩样品以20∶1分流比注入GC进行分析。根据标准曲线计算质量浓度，取平均值，计算回收率。

1.3.7 重组实验

酒样的风味轮廓分析：首先小组成员反复多次嗅闻原始酒样，根据小组成员嗅闻结果选择如下8 种属性作为酒样的香气属性，分别为果香（己酸乙酯）、花香（2-苯乙醇）、酸（乙酸）、坚果（三甲基吡嗪）、醇香（乙醇）、甜（麦芽酚）、青草（反-2-辛烯醛）和药味（4-甲基苯酚）；然后要求10 名评估成员（6 名女性和4 名男性，平均26 岁）以0～5 分对该酒样的8 种香气属性强度进行打分；最后，将小组成员获得的平均值绘制香气轮廓图。

重组实验对比分析：根据定量结果和文献中报道的阈值，计算得到OAV，以将53%乙醇溶液作为重组基质，将OAV大于1的17 种化合物按定量得到的浓度配制成混合溶液，室温平衡30 min，得重组酒样。按照上述相同的方法对重组的酒样进行感官评价，绘制出相应的香气轮廓图。

以上所有感官实验均在（23±1）℃的品评室内进行。

1.4 数据处理

通过Agilent MSD ChemStation E.02.01.1177及Thermo Xcalibur 3.0.63软件对所得到的总离子流色谱图进行解析，1.3.6节实验均进行3 次平行实验，酒样中化合物定量结果以平均值表示；统计感官评价数据，采用Microsoft Office Excel 2016进行相应的数据处理和分析，使用Adobe Illustrator CS6 16.0、OriginPro 9.0软件绘制图形。

2 结果与分析

2.1 香气活性成分的鉴定

图2 酒样中总离子流图和香气化合物的FD因子比较Fig. 2 Total ion current chromatogram and flavor dilution factors (log4 FD) of aroma compounds in NBF from LLE of ZD Baijiu

表1 酒样香气成分GC-MS-O鉴定结果Table 1 Aroma compounds identified in ZD Baijiu by GC-MS-O

续表1

由于分离过程可显著降低各组分的复杂程度，正如Fan Wenlai等[31]的研究结果，将得到的提取物进一步分离成NBF和AF组分，可减少化合物在质谱中的共流出。

本实验通过GC-O分析NBF组分，按流出时间先后顺序共嗅闻到40 个不同香气（包含了AF组分流出物的香气），FD因子包含4～4 096（图2），结合表1可以看出果香和酸甜是酒样的主要风味贡献。通过质谱、RI、香气特征和标准品比对等方法在酒样中共鉴定出35 种香气化合物（表1），包括14 种酯（13 种脂肪酯和1 种芳香酯）、10 种醇（6 种脂肪醇、3 种芳香醇和1 种含硫醇）、5 种酸、3 种酮、1 种醛、1 种酚和1 种芳香族化合物。其中，其中FD因子较高（4 096）的是具有酸臭腐败味的异丁酸、具有酸甜果香的月桂酸乙酯、具有谷物粮食和药味的愈创木酚和具有强烈花香的2-苯乙醇。这4 种化合物在葡萄酒[32]、威士忌[33]等其他类型酒以及芝麻香型[34-35]、清香型[22,24,36]白酒等都被报道过。另一种FD因子大于1 024，且具有强烈刺鼻酸味的物质为乙酸（15）。此外，FD因子大于16的有3-甲基丁醇（FD=256，腐臭、霉味）、未知物（FD=256，芝麻、谷物）、糠醛（FD=64，土豆、坚果、甜味）、苯甲醇（FD=64，花香）、乙酸乙酯（FD=16，菠萝、果味）、异丁酸乙酯（FD=16，辛辣、橡胶、发酵）、丁酸（FD=16，酸臭、腐败）、3-苯丙酸乙酯（FD=16，花香）、辛酸（FD=16，汗味）和未知物（FD=16，烘烤）。这些化合物可能对志都五谷白酒的整体香气具有重要贡献。还有16 种化合物FD因子小于4，但大多数在汾酒和其他白酒[37-38]中已被鉴定出。

通过对比文献发现，异丁酸乙酯、2-甲基丁醇、3-甲基-2-丁烯-1-醇、5-羟基-2,7-二甲基-4-辛酮、3-甲硫基丙醇、(2,2-二乙氧基乙基)-苯、4-苯基-3-丁烯-2-醇、2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-羟基-4-甲基-2,5-环己二-1-酮、棕榈酸甲酯、硬脂酸乙酯均在清香型白酒中首次嗅闻到[24,29,39-41]。其中，异丁酸乙酯曾在浓香、酱香、芝麻香、兼香、药香中被嗅闻到，2-甲基丁醇曾在浓香、酱香、芝麻香、药香中被嗅闻到，3-甲硫基丙醇仅在芝麻香中被嗅闻到，而3-甲基-2-丁烯-1-醇、5-羟基-2,7-二甲基-4-辛酮、(2,2-二乙氧基乙基)-苯、4-苯基-3-丁烯-2-醇、2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-羟基-4-甲基-2,5-环己二-1-酮、棕榈酸甲酯、硬脂酸乙酯均为首次在白酒中嗅闻到[1]。然而，被认为是清香型白酒关键香气成分的β-大马酮[28]在本研究中没有检测到。

2.2 香气化合物的定量和OAV分析

对志都五谷酒香气化合物中有标准品的30 种化合物进行定量，并计算OAV，结果分别如表2、3所示。

如表2 所示，所有定量的化合物中，3-甲基丁醇含量最大（229.776 75 mg/L），其次是乙酸乙酯（140.306 49 mg/L），其他含量较高的物质为2-甲基丁醇（101.223 24 mg/L）、2-苯乙醇（78.284 68 mg/L）。乙酸乙酯作为清香型白酒的主体香气物质，在酒样中的含量也较大，且乙酸乙酯大于乳酸乙酯与前期报道[42]类似。特别地，酒样中的乳酸乙酯含量显著低于其他清香型白酒，乙乳比（乙酸乙酯/乳酸乙酯）为33.22，是汾酒（1.24）的26.79 倍，是老白干（0.57）的58.28 倍[22]，这可能是影响志都五谷酒的独特香气的原因之一。此外，具有明显花香香气的2-苯乙醇含量较大，为78.284 68 mg/L，又由于其具有最高的FD因子（4 096）且与酒样整体的花香属性相关，可被认为是重要的香气贡献物质。酸类化合物中乙酸（23.129 58 mg/L）和异丁酸（17.324 59 mg/L）含量与FD因子正相关。另外3 种酸（丁酸、己酸、辛酸）质量浓度在0.380～1.800 mg/L以内，含量较低。FD因子较大的愈创木酚（4 096）质量浓度较低（0.572 9 mg/L），含硫化合物3-甲硫基丙醇质量浓度也较低（0.160 91 mg/L）。

表2 志都五谷酒30 种香气成分定量结果Table 2 30 Odorants in ZD Baijiu quantified by GC-FID and GC-MS

如表3所示，17 种香气物质（OAV＞1）对酒样的整体香气贡献较大，其中酯类最多，有6 种，其次是醇类5 种，酸类2 种，酚类、醛、酮、含硫化合物各1 种。按OAV大小排序依次为乙酸异戊酯（131.1）、3-苯丙酸乙酯（121.3）、辛酸乙酯（74.4）、愈创木酚（44.1）、3-甲硫基丙醇（3 5.8）、异丁酸（1 8.0）、糠醛（11.2）、丁酸（9.9）、月桂酸乙酯（8.7），它们对酒样的整体香气有重要的贡献。这些重要的香气组分与以往主要研究的北方或西北生产的汾酒[24]、牛栏山[39]、青稞酒[40]等有很大程度的相似度。但志都五谷酒与其他清香型白酒的区别为3-甲硫基丙醇和月桂酸乙酯首次作为清香型白酒的重要香气组分，这可能是由于糖化发酵剂的不同使香气成分的前驱物质有差别，汾酒、牛栏山均以中低温大曲发酵，而志都五谷酒以小曲发酵，同时材料配比和工艺区别也会导致香气成分的差异，使得清香型的重要香气化合物不完全相同。

表3 志都五谷酒30 种香气成分阈值及OAVTable 3 Odor thresholds and OAVs of 30 aroma compounds in ZD Baijiu

2.3 重组分析

图3 志都五谷酒的香气特征和重组模型Fig. 3 Aroma characteristics of ZD Baijiu and aroma reconstitution model

以17 种OAV不小于1的化合物实测浓度配制了重组模型酒样，10 名测评小组成员比较重组酒样与原始酒样的香气轮廓属性，如图3所示。重组样品的香气特征与原始样品的香气特征非常相似，总体相似度为4.55（满分5 分），整体风味略弱于原始酒样。该结果表明这17 种化合物是志都五谷清香型白酒的重要香气化合物。另外，重组模型坚果香气略低于原始酒样，可能是由于化合物11（OAV 256，芝麻、谷物）、39（OAV 16，烘烤）未得到鉴定的原因[34]。

3 结 论

综上所述，本研究通过液液萃取技术提取清香型志都五谷白酒香气成分，采用GC-MS-O联用仪结合香气提取稀释分析方法，共嗅闻得到40 种香气活性物质，其中4 种化合物（异丁酸、月桂酸乙酯、愈创木酚、2-苯乙醇）表现出最高的FD因子。再通过直接进样、液液萃取、顶空-SPME结合GC-MS分析，利用质谱、RI、香气特征及标准品比对的方法定性出志都五谷酒中的35 种香气活性化合物，5 种未知物，其中有7 种香气活性物质首次在白酒中嗅闻到，10 种香气活性物质首次在清香型白酒中嗅闻到。以乙酸肉桂酯、4-辛醇和2-甲基己酸为内标对其中30 种香气成分进行内标标准曲线法定量，并计算其OAV，结合FD因子和OAV，结果显示在志都五谷酒中乙酸异戊酯（FD=4，OAV=131.1，下同）、3-苯丙酸乙酯（16，121.3）、愈创木酚（4 096，44.1）、异丁酸（4 096，18.0）、月桂酸乙酯（4 096，8.7）、3-甲硫基丙醇（4，35.8）、乙酸乙酯（16，4.3）、2-苯乙醇（4 096，2.7）、3-甲基丁醇（256，1.3）为其重要的香气活性物质，其中月桂酸乙酯和3-甲硫基丙醇首次被认为是清香型白酒的重要香气组分。以17 种OAV大于1的香气物质进行香气重组实验，重组模拟酒样与真实酒样的香气轮廓非常相似，达到4.55 分（满分5 分）。