抗耐药性大肠杆菌乳酸菌的筛选及抑菌机制

孙 悦，刘佳伊，陈 璐，杜 宏，白凤翎,*，吕欣然,*，张德福，郭晓华，励建荣

（1.渤海大学食品科学与工程学院，辽宁省食品安全重点实验室，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，大连工业大学和渤海大学海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁 锦州 121013；2.山东美佳集团有限公司，山东 日照 276800）

大肠埃希氏菌（Escherichia coli），俗称大肠杆菌，是鸡肉及鸡肉制品中的重要致病菌[1-3]，目前，由于我国鸡禽业从传统的散养方式转变为高密度养殖方式，增大了鸡群体的发病率，同时也增加了抗生素在养殖过程中的使用量，但长期使用抗生素会导致细菌产生耐药性，引起鸡禽局部或全身感染，严重时可造成全群覆灭，会给鸡禽养殖业造成巨大的经济损失[4-5]。此外，E. coli产生的耐药性能通过食物链快速而广泛的传播，使人源、畜源致病性E. coli获得相同的耐药基因，使其产生相同的耐药谱，耐药性的传播将衍生为全球公共卫生焦点问题，对人类健康和流行病的防治构成严重威胁[6]。研究发现，E. coli易对阿奇霉素、环丙沙星、四环素等药物产生耐药性[7]，因此亟需开发出一类安全高效且可以对抗多重耐药菌的抗菌剂。生物抗菌剂具有安全高效、不易产生耐药性和无毒副作用等优点，是控制食品中耐药菌的优良选择[8]。

乳酸菌作为一种新型生物抗菌剂，目前已在肉制品、乳制品、果蔬、水产品等领域取得良好的应用效果，其主要通过产生有机酸、细菌素等代谢物质抑制细菌的生长繁殖[9-10]。Perales等[11]用乳酸菌细菌素AS-48和Nisin抑制从新鲜的山羊奶酪中提取出4 株耐药性金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），其最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）均在0.16～0.43 μmol/L之间，当二者协同处理指示菌时，MIC下降至0.04～0.05 μmol/L之间。杨柳[12]应用中药丹参提取物抑制耐环丙沙星的E. coli，MIC为253 μg/mL，当其与环丙沙星联用时，M I C 仅为原来的一半。兰仕梅等[13]用连翘单独作用于多重耐药E. coli时，MIC为125 mg/mL，当连翘与四环素联合作用时，对耐药性E. coli的MIC为62.5 mg/mL。目前，关于从传统发酵食品中分离出抗耐药性E. coli的乳酸菌及其拮抗作用机制研究比较鲜见[14]。

本研究以从河北石家庄养鸡场鸡粪中分离出的对阿奇霉素、大环内酯类、氯霉素、喹诺酮类耐药的E. coli为目标菌，采用牛津杯打孔法从辽宁葫芦岛酸菜汤分离筛选对耐药性E. coli拮抗活性较强的乳酸菌。通过测定乳酸菌粗提物对耐药性E. coli电导率、胞外蛋白、紫外吸收物质含量，初步探究乳酸菌粗提物对耐药菌的作用机制。以期为利用生物抗菌剂控制耐药菌提供一定的理论基础和应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品与菌株

酸菜购于辽宁葫芦岛市场；耐药性E. coli0001为河北石家庄养鸡场鸡粪中分离，保藏于本院微生物学与分子生物学实验室。

1.1.2 培养基与试剂

LB培养基、MRS培养基 北京奥博星生物技术有限责任公司；阿奇霉素、阿莫西林、氯霉素、环丙沙星、四环素、亚胺培南、磷霉素、庆大霉素、多黏菌素、头孢他啶10 种抗生素（质量浓度均为15 μg/mL）上海广锐生物科技有限公司；琼脂糖 美国Sigma公司；TaqPCR Master mix、细菌基因组DNA快速抽提试剂盒、DNA Marker-D 生工生物工程（上海）股份有限公司；乳酸菌生化鉴定管 杭州天合微生物试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

DL-CJ-2N型超级洁净工作台 东联哈尔（北京）仪器制造有限公司；DYY-8C电泳仪 北京市六一仪器厂；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪、5804R冷冻高速离心机 德国艾本德股份有限公司；Cheimdox XRS凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司；S-4800扫描电镜 日本日立公司；赛福智能生化培养箱宁波海曙赛福实验仪器厂；UV2550紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；PHSJ-3F pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；FA1004精密电子天平 上海恒平科学仪器有限公司；IKA Vortex GENIUS 3振荡器 德国IKA公司；GI54DS立式高压蒸汽灭菌锅 致微（厦门）仪器有限公司；DZF-6050型真空干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分离

参照文献[15]。无菌条件下取适量酸菜汤样品，采用无菌接种环挑取样品汁液1 环，划线于含1.0% CaCO3的MRS固体培养基，37 ℃条件下培养48 h，选取有溶钙圈的乳白色典型菌落进行过氧化氢酶实验和革兰氏染色。

1.3.2 乳酸菌粗提物的制备

将-80 ℃保存的乳酸菌菌株以2%的接种量在MRS液体培养基中活化3 代，4 ℃、10 000 r/min离心15 min，用0.45 μm滤菌器过滤上清液，得无细胞上清液。将乳酸菌上清液和乙酸乙酯按5∶1的比例加入至分液漏斗中，充分振荡混匀，静置5 min出现明显分层现象，取上层乳化液倒入旋转蒸发瓶中，该萃取步骤重复5 次，并将得到的乳化液统一收集，真空条件下55 ℃、100 r/min旋转蒸发至液体颜色澄清，统一保存。在真空度0.420、-40 ℃条件下真空冷冻干燥48 h至粉末颗粒状，后置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3.3 供试菌菌悬液的制备

将河北石家庄养鸡场鸡粪中分离的耐药性E. coli 0001以2%的接种量接种于MRS液体培养基中，传3 代，30 ℃培养24 h，用生理盐水稀释浓度至1.0×106CFU/mL。

1.3.4 乳酸菌菌株鉴定

1.3.4.1 生理生化反应

参照文献[16-17]对乳酸菌菌株进行生理生化鉴定。

1.3.4.2 菌株的16S rDNA鉴定

参 照 文 献[ 1 8 ] 。 P C R 扩 增 引 物 ： 2 7 f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492r（5’-TACGGYTACCTTTGTTACGACTT-3’）。PCR应用25 μL扩增反应体系：上下游引物各1.0 μL，2.0 ng/μL DNA模板1.0 μL，10 μmol/L上下游引物各1.0 μL，Taq PCR Master mix 12.5 μL，用超纯水补足到25 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，循环30 次，4 ℃保温。

1.3.5 乳酸菌粗提物对耐药性E. coli抑菌机理分析

1.3.5.1 乳酸菌粗提物对耐药性E. coli的MIC

参照Rapper等[19]的方法。将冻干后的菌株XCT1-1粗提物分别加至10 mL LB液体培养基中，使其终质量浓度分别为24、12、6、3、1.5、0.75 mg/mL。再分别加入200 μL 1.0×106CFU/mL E. coli菌悬液，30 ℃培养24 h，通过肉眼观察到无浑浊现象对应的浓度即为乳酸菌的MIC。

1.3.5.2 不同抗菌药物与乳酸菌粗提物复合对耐药性E. coli拮抗作用

参照王唯霖[20]的方法。采用牛津杯打孔法，每个孔均加入菌株XCT1-1粗提物（0.75MIC），再相应加入阿奇霉素、阿莫西林、氯霉素、环丙沙星、四环素、亚胺培南、磷霉素、庆大霉素、多黏菌素、头孢他啶10 种具有代表性的药敏纸片，30 ℃培养24 h。

1.3.5.3 乳酸菌粗提物对耐药性 E. coli电导率的影响

参照范宇[21]的方法。分别在10 mL E. coli菌悬液中加入菌株XCT1-1粗提物（0.75MIC）、阿奇霉素、菌株XCT1-1粗提物（0.75MIC）+阿奇霉素，同时以未经处理的E. coli菌悬液为对照组。30 ℃恒温培养，每隔2 h取样，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，分别取其上清液测定电导率。

1.3.5.4 乳酸菌粗提物对耐药性 E. coli胞外蛋白的影响

参考Bradford[22]的方法，分别取1 mL 1.3.5.3节方法所得的上清液，加入5 mL考马斯亮蓝G-250溶液，室温下反应2 min，在595 nm波长处测定其OD值，并按下式计算胞外蛋白含量：

1.3.5.5 乳酸菌粗提物对耐药性 E. coli紫外吸收物质的影响

按LV Feng等[23]的方法。分别取1 mL 1.3.5.3节方法所得的上清液，260 nm波长处的吸光度即为核酸泄漏含量。

1.3.5.6 乳酸菌粗提物对耐药性 E. coli细胞结构的影响

参照Bueno等[24]的方法。分别在 E. coli菌悬液中加入菌株XCT1-1粗提物（0.75MIC）、阿奇霉素、菌株XCT1-1粗提物（0.75MIC）+阿奇霉素，同时以 E. coli菌悬液为对照组。4 ℃、10 000 r/min离心10 min，收集菌体。在2.5%戊二醛溶液中4 ℃固定过夜，用0.1 mol/L pH 7.2磷酸盐缓冲液洗涤2 次，除去残留戊二醛，分别用50%、80%、100%乙醇进行脱水处理，用胶头滴管取适量滴于洁净盖玻片，自然晾干，喷金镜检。

1.4 数据处理与统计分析

2 结果与分析

2.1 抗耐药性 E. coli乳酸菌的分离和初筛

从酸菜汤中共分离得到51 株具有白色溶钙圈的典型菌落，经革兰氏染色和过氧化氢酶实验确定39 株为乳酸菌。采用牛津杯打孔法从39 株乳酸菌中筛选出6 株对耐药性E. coli具有拮抗活性的乳酸菌，分别为菌株XCT1-1、XCT1-2、XCT1-3、XCT1-4、XCT1-5、XCT1-6，其对耐药性E. coli的抑菌直径分别为20.31、15.42、15.69、11.18、14.96 mm。其中，菌株XCT1-1对耐药性E. coli抑菌直径最大（图1），因此，选择菌株XCT1-1进行下一步研究。

图1 乳酸菌对耐药性E. coli拮抗作用Fig. 1 Antagonistic effect of lactic acid bacteria on drug-resistant E. coli

2.2 乳酸菌菌株鉴定

2.2.1 生理生化鉴定

菌株XCT1-1生理生化鉴定结果见表1，依据文献[16-17]检索可初步判断菌株XCT1-1为乳杆菌属。

表1 菌株XCT1-1生理生化实验结果Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain XCT1-1

2.2.2 16S rDNA鉴定

图2 菌株XCT1-1的16S rDNA基因扩增电泳图Fig. 2 PCR amplification of 16S rDNA gene of strain XCT1-1

由图2可知，菌株XCT1-1在1 450 bp处左右出现特异性条带，表明目标片段被成功扩增。将PCR扩增产物进行测序分析，序列在美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的GenBank数据库中进行BLAST同源性比对，选取同源性较高的模式菌株，采用MEGA7.0构建系统发育树，结果见图3。菌株XCT1-1和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）EU600907.1聚于一支，亲缘关系最近，相似度达97%。因此，鉴定菌株XCT1-1被鉴定为植物乳杆菌。

图3 菌株XCT1-1的系统发育树Fig. 3 Phylogenetic tree of strain XCT1-1

2.3 乳酸菌粗提物对耐药性E. coli抑菌机理分析

2.3.1 乳酸菌粗提物对耐药性E. coli的MIC

耐药性E. coli经不同质量浓度植物乳杆菌XCT1-1粗提物处理12 h后，肉眼观察到6.0 mg/mL及以上质量浓度无浑浊现象，即植物乳杆菌XCT1-1 MIC为6.0 mg/mL。Yi Lanhua等[25]研究发现，从江水中分离出的棒状乳杆菌（L. coryniformis）XN8产生的细菌素lactocin XN8-A对E. coli和S. aureus的MIC均为6.85 mg/mL，与本实验的研究结果相似。

2.3.2 不同抗菌药物与乳酸菌粗提物复合对耐药性E. coli的拮抗作用

图4 不同抗菌药物和植物乳杆菌粗提物复合对耐药性E. coli的拮抗作用结果Fig. 4 Antagonistic effects of different antibacterial drugs and L. plantarum on drug-resistant E. coli

由图4可知，阿奇霉素、阿莫西林、氯霉素、环丙沙星、四环素5 种药物对E. coli均无抑制作用。但加入植物乳杆菌XCT1-1粗提物后，抑菌圈直径分别达到27.56、27.31、28.91、27.89、28.90 mm，同时也均大于单独添加植物乳杆菌XCT1-1粗提物的抑菌圈直径（P＜0.05）。结果表明，植物乳杆菌XCT1-1粗提物对耐药性E. coli有拮抗活性，同时还能提高了耐药性E. coli对药物的敏感性。选择E. coli耐受的其中一种药物阿奇霉素进行下一步的研究。

2.3.3 乳酸菌粗提物对耐药性 E. coli电导率的影响

图5 植物乳杆菌XCT1-1粗提物对耐药性E. coli电导率的影响Fig. 5 Effect of the culture supernatant extract of L. plantarum XCT1-1 on the electrical conductivity of drug-resistant E. coli

细菌菌悬液的电导率变化是细胞膜渗透性变化的间接表现形式[26]。由图5可知，随着处理时间的延长，耐药性E. coli电导率整体呈上升趋势。经植物乳杆菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）、植物乳杆菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）和阿奇霉素共同处理过的耐药性E. coli菌悬液电导率值明显高于未经处理的耐药性E. coli菌悬液（P＜0.05）。在处理末期第10小时，乳酸菌粗提物最大程度提高了阿奇霉素对耐药性E. coli的敏感性，且经植物乳杆菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）、植物乳杆菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）和阿奇霉素共同处理过的实验组与未经处理的耐药性E. coli菌悬液相比电导率值分别增加了20.54%、21.93%（P＜0.05）；经阿奇霉素处理的实验组与未经处理的耐药性E. coli菌悬液相比电导率值无显著性差异。结果表明：植物乳杆菌XCT1-1粗提物、植物乳杆菌XCT1-1粗提物和阿奇霉素共同作用可以改变耐药性E. coli细胞膜的通透性，共同作用效果强可能是由于乳酸菌粗提物提高了阿奇霉素对耐药性E. coli的敏感性。侯媛媛[27]在处理末期第8小时，用大黄酸处理耐药性E. coli和肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica subsp. enterica）的实验组比未经处理组电导率值分别高约67.50%、66.67%，与本研究结果相似。

2.3.4 乳酸菌粗提物对耐药性E. coli胞外蛋白的影响

图6 植物乳杆菌XCT1-1粗提物对耐药性E. coli胞外蛋白含量的影响Fig. 6 Effect of the culture supernatant extract of L. plantarum XCT1-1 on the extracellular protein content of drug-resistant E. coli

蛋白质泄漏是评定细菌细胞膜完整性的一个重要指标[28]。由图6可知，随着处理时间的延长，耐药性E. coli胞外蛋白含量呈现上升趋势。其中经植物乳杆菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）、植物乳杆菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）和阿奇霉素共同处理过的耐药性E. coli菌悬液的胞外蛋白含量明显高于未经处理的耐药性E. coli菌悬液（P＜0.05）。在处理末期第10小时，乳酸菌粗提物最大程度提高了阿奇霉素对耐药性E. coli的敏感性，且经植物乳杆菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）、植物乳杆菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）和阿奇霉素共同处理过的实验组与未经处理的耐药性E. coli菌悬液相比，胞外蛋白含量分别增加了25.24%、27.93%（P＜0.05）；经阿奇霉素处理的实验组与未经处理的耐药性E. coli菌悬液相比，胞外蛋白含量无显著性差异。结果表明：植物乳杆菌XCT1-1粗提物、植物乳杆菌XCT1-1粗提物和阿奇霉素共同作用可以破坏耐药性E. coli细胞壁和细胞膜，共同作用效果强可能是由于乳酸菌粗提物提高了阿奇霉素对耐药性E. coli的敏感性。王维霖[20]在处理末期第8小时，用五倍子提取物处理耐药性E. coli的实验组比未经处理组胞外蛋白含量高约75%，与本研究结果相似。

2.3.5 乳酸菌粗提物对耐药性E. coli紫外吸收物质的影响

图7 植物乳杆菌XCT1-1粗提物对耐药性E. coli紫外吸收物质的影响Fig. 7 Effect of the culture supernatant extract of L. plantarum XCT1-1 on UV absorbing compounds of drug-resistant E. coli

核酸的OD260nm值用作评价细胞膜完整性的指标[29]。由图7可知，经植物乳杆菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）、植物乳杆菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）和阿奇霉素共同处理过的耐药性E. coli菌悬液核酸泄漏值显著高于未经处理的耐药性E. coli菌悬液（P＜0.05）。在处理末期第10小时，乳酸菌粗提物最大程度地提高了阿奇霉素对耐药性E. coli的敏感性，且经植物乳杆菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）、植物乳杆菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）和阿奇霉素共同处理过的实验组与未经处理的耐药性E. coli菌悬液相比，核酸泄漏值分别增加了63.56%、77.12%（P＜0.05）；经阿奇霉素处理的实验组与未经处理的耐药性E. coli菌悬液相比，核酸泄漏值无显著性差异。结果表明：植物乳杆菌XCT1-1粗提物、植物乳杆菌XCT1-1粗提物和阿奇霉素共同作用可以破坏耐药性E. coli细胞壁和细胞膜，共同作用效果强可能是由于乳酸菌粗提物提高了阿奇霉素对耐药性E. coli的敏感性。Alavi等[30]采用松萝酸处理耐药性E. coli的实验组比未经处理组紫外吸收物质含量高约70.59%，与本研究结果相似。

2.3.6 乳酸菌粗提物对耐药性E. coli细胞结构的影响

图8 植物乳杆菌XCT1-1粗提物对耐药性E. coli作用的扫描电镜结果Fig. 8 SEM photographs showing of the effect of the cultute supernantant extract of L. plantarum XCT1-1 on the cell structure of drug-resistant E. coli

由图8a可知，未经处理的耐药性E. coli菌体细胞表面圆润光滑，结构完整；由图8b可知，经植物乳杆菌XCT1-1粗提物处理后的耐药性E. coli菌体细胞边缘出现褶皱并有溶解迹象；由图8c可知，经植物乳杆菌XCT1-1粗提物和阿奇霉素共同作用处理后的耐药性E. coli细胞完整性完全丧失，细胞溶解程度进一步增加，细胞整体结构坍塌。Al-Wrafy等[31]用噬菌体蛋白PAPP使耐药性铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）细胞膜被破坏，有溶解迹象，噬菌体蛋白PAPP与哌拉西林叠加处理，耐药性P. aeruginosa细胞结构进一步被破坏，细胞基本溶解。该结果与本研究结果相似。

3 结 论

本研究从辽宁葫芦岛酸菜汤中筛选出1 株对耐药性E. coli具有较强拮抗活性的植物乳杆菌XCT1-1，抑菌直径达20.31 mm。经菌株XCT1-1粗提物、菌株XCT1-1粗提物和阿奇霉素共同作用耐药性E. coli后，导致其胞外电导率增加，胞内蛋白合成受到影响，胞内核酸发生泄漏。扫描电镜结果进一步表明，菌株XCT1-1粗提物、菌株XCT1-1粗提物和阿奇霉素共同处理耐药性E. coli后，可破坏E. coli的细胞壁和细胞膜，前者菌体表面出现褶皱，后者菌体表面褶皱严重，菌体细胞整体结构坍塌。以上结果表明，植物乳杆菌XCT1-1粗提物、植物乳杆菌XCT1-1粗提物和阿奇霉素共同作用都是通过膜损伤发挥拮抗作用，并推断共同作用效果强可能是由于乳酸菌粗提物提高了阿奇霉素对耐药性E. coli的敏感性，且乳酸菌和阿奇霉素可发生协同拮抗效应。研究为控制食品中耐药性E. coli和研究抗耐药菌生物制剂提供一定的理论基础。