胶红酵母与酿酒酵母共发酵对干红葡萄酒香气与色泽的影响

马 娜，王星晨，孔彩琳，陶永胜,2,*

（1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心，陕西 杨凌 712100）

香气是葡萄酒感官评价的重要指标，也是影响葡萄酒质量风格的重要因素。品种香气来源于葡萄果实自身风味前体物质，通常以香气糖苷的形式存在，发酵过程中由酵母产生的糖苷酶水解释放。另外，酵母代谢产生的发酵香气也是构成葡萄酒香气的主要方面[1]。我国部分葡萄酒产区位于季风气候区，葡萄成熟期雨热同季，导致原料常常在达到技术成熟度之前采收。葡萄成熟期香气糖苷随果实中糖含量增加减缓而不断积累[2]。季风性气候容易导致原料香气品质降低，酚类物质等积累不足，进而使所酿葡萄酒质量下降。因此，研究季风性气候产区红葡萄酒增香酿造提高其风味质量的理论及技术应用手段具有重要意义。

酵母菌因其独特的代谢活动和发酵特性显著影响葡萄酒的质量[3]。酿酒酵母具有较高的乙醇转化率、发酵纯净彻底等优点，在葡萄酒酿造中被广泛使用[4]。但其单一接种发酵可能使葡萄酒风味同质化，不利于酒的复杂度的形成[5]。近年来，越来越多的研究发现，一些非酿酒酵母对葡萄酒的风味形成具有积极作用[6-7]。与酿酒酵母相比，某些非酿酒酵母具有较高的糖苷酶或酯酶活性，利于水解香气前体物质，调节酯类生成，从而增强香气特征[8-10]。大多数非酿酒酵母乙醇耐受性低，为了保证发酵完全且避免产生不良副产物，通常将其与酿酒酵母进行混菌发酵[11]。例如，发酵毕赤酵母与酿酒酵母的混合发酵能够增加酒中高级醇、乙酸酯以及中链脂肪酸的含量[8]。研究发现，非酿酒酵母与酿酒酵母的混菌发酵对葡萄酒的品质影响与所用非酿酒酵母的菌株和发酵策略有关[12]，本实验室前期筛选获得一株具有高糖苷酶活性的胶红酵母菌株（Rhodotorula mucilaginosa）北-29，而目前关于胶红酵母在红葡萄酒增香酿造中的应用研究还较少。除香气外，酚类物质和色泽是决定红葡萄酒风味质量的关键因素。本实验研究优选酵母不同混合发酵策略对红葡萄酒香气和色泽品质的影响效果，通过揭示混菌发酵引起的香气成分、香气特征及酚类物质组成的变化，确定理想的酵母接种策略，为季风气候区红葡萄酒的增香酿造提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄品种为梅鹿辄（Merlot），于2018年9月采收自陕西省合阳县西北农林科技大学葡萄试验示范站，还原糖190.5 g/L，总酸6.5 g/L（以酒石酸计），卫生状况良好。胶红酵母菌株北-29为本实验室优选，由中国典型培养物保藏中心的菌株保藏，编号为M2013660；F33酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）活性干粉 法国Laffort公司。

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、琼脂、亚硫酸溶液（含6% SO2）（均为分析纯） 天津化学试剂公司；乙酸乙酯、乙酸异戊酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、异丁醇、异戊醇、1-辛醇、里哪醇、β-大马酮、苯甲醇、苯乙醇（均为色谱纯，纯度≥97%）美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）装置配有57330-U联用手柄，DVB/CAR/PDMS萃取纤维（50/30 μm，2 cm） 美国Supelco公司；QP2020气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司；DB-WAX毛细管柱（60 m×0.25 mm，0.25 µm）、Cary-60UV-vis紫外-可见分光光度计 美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 理化指标

参考GB/T 15038—2006《葡萄酒果酒分析方法》，测定总糖、还原糖、总酸、挥发酸、乙醇体积分数等理化指标。

1.3.2 葡萄酒酿造实验

酵母接种方案：2 种酵母菌株经酵母浸出粉胨葡萄糖培养基活化扩培接种于葡萄醪中。同时接种：胶红酵母和酿酒酵母按不同菌数比10∶1（C10∶1）、4∶1（C4∶1）、1∶1（C1∶1）、1∶4（C1∶4）、1∶10（C1∶10）同时接种；顺序接种（S1∶1）：提前48 h接种胶红酵母，然后接种酿酒酵母，2 种酵母的接种比例为1∶1。单位接种量为1×106cells/mL。实验以酿酒酵母纯发酵为对照，每一酿造处理重复2 次。

酿造工艺：筛选成熟卫生的葡萄浆果，除梗破碎，分装至20 L玻璃罐中，添加50 mg/L SO2混匀，4 ℃低温浸渍24 h。随后升温至20 ℃时，按照上述接种方案在等分后的葡萄醪中接种酵母启动发酵。控制发酵温度25～27 ℃，每天监测相对密度和温度。发酵旺盛期添加蔗糖调整目标酒度到11.5%（V/V）。当相对密度降至1.020时分离皮渣继续发酵，温度控制在18～20 ℃。当相对密度低于0.996时，测还原糖含量，低于2 g/L时，添加50 mg/L SO2终止发酵，转入干净卫生的10 L玻璃罐中，4 ℃条件下满罐密封贮存，期间进行几次倒罐以分离沉淀。酒样密封贮存6 个月后取样分析。

1.3.3 多酚及颜色指标测定

1.3.3.1 总酚、黄酮醇、酒石酸酯和花色苷含量

取0.5 mL酒样，用10%乙醇溶液稀释10 倍。取0.25 mL稀释后酒样，加入0.25 mL 0.1% HCl-95%乙醇溶液和4.55 mL 2%盐酸-乙醇溶液混匀，室温静置15 min。采用10 mm比色皿，测定样品在280、320、360、520 nm波长处的吸光度。根据没食子酸（10%乙醇）、槲皮素（95%乙醇）、咖啡酸（10%乙醇）和二甲花翠素-3-葡萄糖苷（10%乙醇）稀释液在各波长下建立的标准曲线，分别计算出对应总酚（A280nm）、酒石酸酯（A320nm）、黄酮醇（A360nm）、花色苷（A520nm）的含量[13-14]。

1.3.3.2 单体花色苷/辅色花色苷/聚合花色苷比例

调节样品pH值至3.6，取2 mL酒样加入20 μL 10%（V/V）乙醛溶液，反应45 min后测定其在520 nm波长处的吸光度A0；用模拟酒稀释样品20 倍后测定其在520 nm波长处的吸光度A1；取2 mL酒样，加入160 μL 50 mg/mL SO2，反应后测定其在520 nm波长处的吸光度A2。吸光度测定前经0.45 μm滤膜过滤，每个处理重复3 次。样品中各相对比例的计算公式如下[14]：

1.3.3.3 色度和色调

酒样稀释10 倍后，经0.45 μm滤膜过滤，利用10 mm光程比色皿测定在420、520、620 nm和700 nm波长处的吸光度[13]。计算公式如下：

1.3.3.4 总单宁[14]

取2 mL稀释后酒样（1∶50），加入6 mL 12 mol/L盐酸，密封避光，沸水浴30 min后迅速冷却，再加入1 mL无水乙醇，混匀，在550 nm波长处测定吸光度A1；另取2 mL样品采用相同处理方法，常温放置30 min，在550 nm波长处测定吸光度A2。

1.3.3.5 盐酸指数[14]

取2 mL离心管，加入500 μL酒样、250 μL蒸馏水、750 μL浓盐酸，摇匀后立即取200 μL混合液，加蒸馏水稀释，用紫外分光光度计在280 nm波长处测定吸光度A1；另一组采用相同处理，混合均匀后常温下静置7 h，离心后去除沉淀，取上清液，加入蒸馏水稀释，在280 nm波长处测定吸光度A2。

1.3.3.6 乙醇指数[14]

取5 mL离心管，加入0.4 mL酒样、3.6 mL无水乙醇，混合均匀，用蒸馏水稀释4 倍，在280 nm波长处测定吸光度A1；另一组采用相同处理，混合均匀后常温下静置24 h，离心除去沉淀，取上清液，加入蒸馏水稀释，在280 nm波长处测定吸光度A2。

1.3.3.7 离子化指数[14]

取稀释后酒样，520 nm波长处测定吸光度A1；在酒样中加入70 mg/mL NaHSO3溶液，在520 nm波长处测定吸光度A2；在酒样中加入2.8 mL的0.1 mol/L HCl溶液，加入蒸馏水，在520 nm波长处测定吸光度A3；在酒样中加入2.8 mL的0.1 mol/L HCl溶液，再加入70 mg/mL NaHSO3溶液，在520 nm波长处测定吸光度A4。

1.3.4 香气成分的仪器分析

供试酒样的香气成分采用顶空SPME结合气相色谱-质谱（headspace-SPME-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）联用法进行分析，参考Zhu Mengxu等[15]的方法并有改动。

SPME样品处理：取8 mL酒样和20 μL内标溶液（40 μg/L 2-辛醇）置于20 mL装有磁力搅拌子的顶空瓶中，加入2.0 g NaCl，启动搅拌子，在40 ℃水浴中平衡15 min，然后插入萃取纤维，在40 ℃吸附30 min后立即将萃取头在GC进样口热解吸（230 ℃）5 min。

GC-MS分析条件：不分流进样，保持载气（氦气）恒定流速1.5 mL/min。柱升温程序为40 ℃保持5 min，以2 ℃/min上升至130 ℃，再以5 ℃/min升至220 ℃，保持10 min，总运行时间78 min。进样口温度230 ℃，连接杆温度220 ℃，离子源温度200 ℃，电子电离源，在70 eV质谱扫描范围m/z 35～350。

定性定量分析：采用标准品保留时间对比、保留指数对比和NIST 2017质谱谱库查询进行香气化合物定性。采用内标-标准曲线法定量。通过香气标准品和2-辛醇的相对峰面积建立标准曲线，R2在0.99以上。将准确定性物质代入标准曲线计算获得定量结果。

1.3.5 香气特征的感官分析

感官分析方法具体参照文献[10]进行。品评小组由培训良好的葡萄酒专业学生组成。在分析过程中，每一供试酒样重复分析2 次，将所有酒样随机编号，采用随机区组设计，品尝员从葡萄酒标准香气中选择5～6 个特征词汇描述样品香气特征，并进行量化。最终量化强度值MF（%）由品评小组对某一香气特征词汇的使用频率F（%）和强度平均值I（%）表示。计算公式如下：

MF/%= F×I （10）

1.4 数据分析

不同发酵处理间的数据差异分析采用单因素方差分析（ANOVA），并进行Duncan检验、Tukey检验的多重比较分析。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）研究不同处理酒样中香气成分、酚类物质与颜色指标的分布规律。数据处理运用SPSS 20.0软件实现。

2 结果与分析

2.1 葡萄酒的香气分析

实验测定了酒样的重要理化指标，总糖（以葡萄糖计）＜2 g/L，总酸（以酒石酸计）在4.6 g/L左右，挥发酸（以乙酸计）在0.2～0.3 g/L，乙醇体积分数为（11.5±1）%。由于各项理化指标均符合国标（GB 15037—2006《葡萄酒》）要求且处理间差异较小，所以未对结果进行分析讨论。经SPME-GC-MS对供试酒样中香气成分的定性定量分析，共确定了40 种香气成分，总量为299～357 mg/L。混合发酵酒样S1∶1、C10∶1和C4∶1中香气成分的总含量显著高于酿酒酵母纯发酵酒样（299 mg/L）。其中，S1∶1酒样和C10∶1酒样中香气成分的总含量分别比对照酒样高19.4%和16.4%。16 种香气成分在酒中的浓度与其嗅觉阈值的比值（气味活性值（odor activity value，OAV））大于1，12 种香气成分的OAV在0.1～1。

酒样中共检测出10 种品种香气成分，包括4 种萜烯类物质、1 种C13-去甲类异戊二烯化合物、2 种C6化合物、1 种硫醇和2 种酚酸酯。对OAV大于0.1的品种香气成分含量进行PCA，以揭示不同处理对其整体影响，结果见图1。PC1和PC2分别占数据总体方差的59.3%和24.7%。C6化合物、硫醇和酚酸酯类香气物质集中分布于酒样C4∶1的周围，位于PC1的正向端上，且与C10∶1酒样距离较近。里哪醇和β-大马酮位于PC2的正向端上，距离酒样C4∶1和S1∶1较近。综上分析可知，C4∶1、C10∶1处理能够显著增加酒样中C6化合物、硫醇等物质的含量，而S1∶1处理更利于促进萜烯类物质和β-大马酮的生成。

图1 前2 个PC上的品种香气成分的载荷值和酒样分布Fig. 1 PCA loading plot of PC1 versus PC2 for varietal aroma components and distribution of wine simples

图2 前2 个PC上的发酵香气成分的载荷值和酒样分布Fig. 2 PCA loading plot of PC1 versus PC2 for aroma compounds produced during wine fermentation and distribution of wine samples

发酵香气成分共检测出30 种，包括8 种高级醇、13 种酯类物质、5 种脂肪酸和4 种苯乙基类化合物。对OAV大于0.1的发酵香气成分含量进行PCA，前2 个PC上的发酵香气成分载荷及酒样分布见图2。PC1、PC2分别占数据总体方差的45.3%和27.1%。大部分发酵香气成分和处理C10∶1、C4∶1及C1∶1分布于PC1的正向端，其中高级醇（1-辛醇、1-壬醇、异戊醇）和中链脂肪酸（C6～C12）及其乙酯集中分布，距离酒样C10∶1最近。乙酸乙酯、乳酸乙酯和乙酸β-苯乙酯集中分布于PC2的正向端上，距离酒样C10∶1和S1∶1较近。结合表1数据分析可得，随着优选胶红酵母接种比例的升高，混合发酵酒样中高级醇、中链脂肪酸及其乙酯含量增加，而S1∶1处理有利于提高乙酸酯、苯乙基类化合物的含量。

表1 不同混合发酵处理的供试酒样中香气成分的SPME-GC-MS定量分析结果Table 1 SPME-GC-MS quantification of aroma compounds in dry red Merlot wines made using different inoculation strategies

供试酒样香气特征的感官量化分析结果见图3。酒样中5 种香气特征的MF值较高，且在各处理间存在极显著差异（P＜0.01）。果香（热带水果+甜果+酸果）和浆果类香气特征中，酒样C10∶1和C4∶1的MF值最高，其次是S1∶1和C1∶1酒样。酒样C10∶1和S1∶1的花香类香气特征MF值最高。此外，优选酵母高比例接种处理增加了酒样中动物类（皮革、麝香等）和生青味香气特征，而在对照酒样、S1∶1酒样中对应的MF值较低。分析可得，优选酵母高比例接种处理增强了酒样的果香和花香，但同时也引入了较强的动物味和生青味。S1∶1处理偏重于增强花香，并能降低不良气味。

图3 供试酒样香气特征雷达图Fig. 3 Radar map of aroma characteristics of dry red wines

为进一步揭示不同处理对酒样色泽的影响，对上述各指标进行PCA。如图4所示，前2 个PC分别占总方差的65.1%和15.1%。总花色苷、酒石酸酯、黄酮醇等指标和酒样C4∶1、S1∶1位于第4象限。盐酸指数、聚合花色苷比例、色度、色调等指标和酒样C4∶1、C10∶1集中分布于第2象限。辅色花色苷比例距离酒样C10∶1较近。分析可得，优选酵母接种比例较高的酒样中，酚类物质、总花色苷含量以及单体花色苷、辅色花色苷比例较高，而随着接种比例的降低，聚合单宁、聚合花色苷比例、色度、色调等升高。

图4 前2 个PC上的多酚及颜色指标载荷值及酒样分布Fig. 4 PCA loading plot for polyphenols and color indices and distribution of wine samples

2.2 葡萄酒的色泽分析

实验测定了酒样中13 个多酚与颜色相关指标，结果见表2。除总单宁外，其他参数间均存在显著或极显著差异，说明混合发酵处理对酒样色泽影响效果明显。

表2 混合发酵梅鹿辄干红葡萄酒的多酚和颜色指标（n=2）Table 2 Polyphenols and color indices of dry red wines made using different inoculation strategies (n= 2)

3 讨 论

本研究中混合发酵显著影响了葡萄酒中香气成分的化学轮廓。品种香气成分决定着葡萄酒的品种和区域典型性，主要有萜烯类、C13-去甲类异戊二烯化合物、C6化合物、硫醇等。萜烯类化合物主要由萜烯糖苷酶解释放，一些单萜醇如里哪醇、香茅醇等气味活性较高，赋予葡萄酒花香和柑橘类果香[18]。C13-去甲类异戊二烯是葡萄中类胡萝卜素的衍生物，阈值非常低，具有重要的呈香潜力[19-20]，其中β-大马酮带给葡萄酒花香和甜果香。本研究中，顺序接种处理酒样中萜烯类和β-大马酮含量最高，显著高于酿酒酵母纯发酵酒样，优选酵母高比例接种酒样中次之，可能是由于本株胶红酵母具有高糖苷酶活性，随着存活时间、数量的增加而水解了更多的香气前体物质。C6化合物和硫醇含量随着优选酵母接种比例的升高而显著增加，而在顺序接种酒样中较低。C6化合物是破碎葡萄中由多不饱和脂肪酸经酶促氧化形成的初始产物，通常与草本、青草味有关[19]。大多数挥发性硫醇通过酵母酶解非挥发性含硫前体的C—S键而释放[21-22]。这一结果可能与酵母间的相互作用有关。Anfang等[23]的研究发现商业酵母与毕赤酵母分离物以1∶9比例混合发酵显著提高了酒样中挥发性硫醇3-巯基己基乙酸酯的含量，但其机理尚不清楚。

发酵香气成分主要是酵母在乙醇发酵过程中的代谢副产物。高级醇是其中含量最多的一类化合物。有研究表明，葡萄酒中低于300 mg/L的高级醇会带来令人愉悦的香气复杂性[24]。本研究中，高级醇含量随优选酵母接种比例的升高而显著增加，且总质量浓度低于300 mg/L，除带给葡萄酒醇香特征外，还可能生成乙酸酯、醛等对香气贡献更大的物质。酯类对于大多数酒精饮料的香气至关重要，是果香和花香感知的主要气味物质[25]。本研究中顺序接种和高比例同时接种处理显著提高了酒样中乙酸酯的质量浓度，且远低于引起不良风味的水平（≥100 mg/L）[26]。而适量浓度的乙酸酯尤其是乙酸异戊酯会增加年轻葡萄酒中的水果香气[27]。由此推断，增加的乙酸酯可能给葡萄酒的果香带来积极贡献。与其他发酵香气成分相比，中链脂肪酸乙酯阈值更低，挥发性较高，且具有协同作用，赋予酒类甜果、类似香水的特征，能够显著影响葡萄酒的风味[28-29]。优选酵母高比例接种处理和顺序接种处理均增加了酒样中链脂肪酸乙酯（己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯）的含量。中链脂肪酸乙酯的含量很大程度上取决于底物中链脂肪酸的含量，较少依赖于酶活[30]。而在上述中链脂肪酸乙酯含量较高的酒样中，对应的中链脂肪酸含量也较高。苯乙基类化合物通常具有玫瑰花的香气特征，Lleixa等[31]用非酿酒酵母Hanseniaspora vineae发酵的马卡贝澳（Macabeo）葡萄酒果香和花香更突出，分析表明乙酸苯乙酯的含量高于阈值且远远高于酿酒酵母纯发酵酒样。本研究中，顺序接种处理酒样中苯乙基类化合物含量最高，尤其是OAV＞1的乙酸β-苯乙酯和苯乙醇。

感官分析表明，高比例同时接种处理和顺序接种处理均显著增加了葡萄酒的果香和花香特征。但高比例接种也会引入较强的生青味和动物味，可能与C6化合物、硫醇等含量明显增加有关。相反，顺序接种处理却降低了不良气味。此外，顺序接种处理最大程度地提升了花香特征，推测可能与里哪醇、β-大马酮等高气味活性物质的大量生成有关。

色泽是评价葡萄酒风味质量的重要指标。酚类物质在一定程度上可以反映出葡萄酒的品质优劣，赋予葡萄酒骨架，稳定颜色，具有抗氧化的能力[32-33]。Behrends等[34]的研究发现不同的发酵策略会产生不同的花色苷图谱。本研究中优选酵母较高比例接种和顺序接种处理酒样中总花色苷含量、辅色花色苷比例、黄酮醇含量都较高。盐酸指数表示高聚合单宁的比例。乙醇指数表示与多糖结合的单宁比例。值得注意的是，优选酵母低比例接种（1∶10、1∶4）酒样中聚合花色苷比例、盐酸指数、乙醇指数等都较高，说明处理提高了酒样中成分的聚合化水平，酒样可能老化较快，需要进一步研究。

总体上，优选胶红酵母与酿酒酵母的不同混合发酵策略对葡萄酒的风味质量具有差异明显的影响效果。顺序接种处理在显著增加果香和花香的同时没有产生不良气味，并且有助于改善色泽质量，具有较好的增香酿造潜力。