沙门氏菌噬菌体LPST144尾纤维gp38的序列分析及其结合活性

杨其乐，丁一峰，张 宇，聂若男，李亚萌，王 佳，王小红

（华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070）

沙门氏菌是导致食源性疾病的主要病原菌，在全球范围内，每年约造成9 380万 例肠胃炎疾病，以及15.5万 人死亡[1]。沙门氏菌是一类革兰氏阴性短杆菌，需氧或兼性厌氧，肠杆菌科沙门氏菌属，由肠炎沙门氏菌种和邦戈沙门氏菌种组成[2-3]。沙门氏菌分布广泛，菌型繁多，目前使用标准Kauffman-White方案已鉴定超过2 600 种血清型，而大多数血清型能够在包括人类在内的多种动物宿主中寄生，其中肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌是导致人畜共患病的两种主要血清型[4]。近年来，抗生素的大量使用导致了耐药性沙门氏菌的出现，耐药沙门氏菌的强毒力、高死亡率引起了广泛关注[5]。因此，为预防沙门氏菌对人类健康以及经济发展造成重大危害，对其进行有效的安全监控和监督、建立快速准确的检测方法具有重要意义。

噬菌体作为一种细菌病毒，能够特异性吸附、侵染细菌并完成自我复制[6]，最早发现于一个世纪以前，用于对分子生物学基本原理的探究[7]。在自然环境中，噬菌体几乎无处不在，海洋、土壤、深海喷口以及饮用水、食物中都存在噬菌体。同时，噬菌体也是地球上数量最多的生物体，其数目约为1030～1031，且具有多样性[8]。噬菌体侵染细菌，完成其生命周期的第一步是特异性识别并结合细菌表面受体，其主要识别的细菌表面受体为脂多糖和细菌表面蛋白上特定的残基[9]，噬菌体颗粒中承担这一重要功能的蛋白被称为受体结合蛋白（receptor binding proteins，RBPs），存在于噬菌体尾纤维或者尾刺的末端[10-12]。由于RBPs介导的宿主识别是高度特异性的，因此，可以利用RBPs作为分子识别元件进行宿主菌的特异性检测技术研究[13-14]。

目前报道较多的噬菌体RBPs有：T4 gp37、gp12；T2 gp38；P22 gp9和T7 gp17[15-16]。一般而言，RBPs具有如下特点：具有模块化性质，N端连接噬菌体粒子主体，序列同源性较高，C端为受体识别区决定宿主范围，序列相似度较低；许多已知的RBPs受体识别区富含β结构，通常会形成三聚体且结构稳定[16-17]；许多尾刺蛋白还具有水解活性，目前已知的具有水解活性的尾刺蛋白已被鉴定有215 个，这些RBPs能够降解脂多糖、磷壁酸等生物聚合物，为噬菌体进入细胞膜注入DNA扫清道路[17]；一个噬菌体可以有多个RBPs，例如T4噬菌体具有短尾纤维（gp12）和长尾纤维（gp37）[18]，且在吸附过程中承担着不同的功能，T4噬菌体与宿主菌靠近后，长尾纤维（gp37）识别连接细菌表面一级受体，此时的结合可逆，随后T4噬菌体在细菌表面依靠长尾纤维移动，当周围有2～3 个一级受体并与之相连后，信号传递导致底板构象改变，释放短尾纤维（gp12），其不可逆地结合宿主二级受体，最后尾部收缩，注入噬菌体DNA[19]。由于RBPs具有以上特点，将其用作检测探针有以下优点：易于大量获得；RBPs具有模块化的性质，可将受体结合区分离，改造优化，可将具有不同宿主范围的RBPs融合表达，扩大宿主范围[20-21]；与易发生重组和突变的完整噬菌体粒子相反，克隆原性在生产过程中保持不变，性质稳定，更适于商业化[16,22]。同时RBPs的一些性质也导致了研究的困难：首先，RBPs序列多样性大，受体识别区序列相似性低，且一种噬菌体可能同时具有一种或者一种以上的RBPs[23]，这些特点导致生物信息学方法预测的困难[24]；其次，了解噬菌体RBPs的结构能极大促进噬菌体识别机制理论的发展，而尾纤维的柔性结构导致结晶困难，因此对结构研究和识别机制理论的揭示和发展造成了巨大的挑战[25]。

本研究分析实验室前期分离得到的1 株沙门氏菌噬菌体LPST144尾纤维gp38的理化性质、遗传进化关系和二级结构，旨在完成尾纤维基因orf38异源表达纯化以及其特异性结合活性的验证，为后续开发基于噬菌体RBPs为分子探针建立沙门氏菌检测方法奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

噬菌体LPST144由实验室前期分离保存，为1 株鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimuriumATCC13311）烈性噬菌体，短尾科，T7类噬菌体；已完成其基因组测序，GenBank登录号为MN252582；鼠伤寒沙门氏菌ATCC13311（S. typhimuriumATCC13311）、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028（S. typhimuriumATCC14028）、鼠伤寒沙门氏菌ST-8（S. typhimuriumST-8）、鼠伤寒沙门氏菌UK-1（S. typhimuriumUK-1）、肠炎沙门氏菌SJTUF10978（S. enteritidisSJTUF10978）、肠炎沙门氏菌SJTUF10984（S. enteritidisSJTUF10984）、肠炎沙门氏菌10960（S. enteritidis10960）、金黄色葡萄球菌6538（Staphylococcus aureus6538）和大肠杆菌T10（Escherichia coliT10）为实验室保藏菌种；沙门氏菌外膜蛋白Ompc为实验室异源表达纯化得到。

根据噬菌体LPST144基因组注释结果，设计上下游引物扩增orf38基因序列，引物序列如下：orf38F：5’-CGGGATCCCGATGGCACTTAAATT-3’，orf38R：5’-CCGCTCGAGCGGATAGAAGTAGTGAAT-3’（下划线分别代表BamH I和XhoI酶切位点），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

限制性内切酶、T4 DNA连接酶、聚会酶链式反应产物回收试剂盒 宝日医生物技术（北京）有限公司；质粒pSmart-I、E.coliBL21 美国Addgene公司；HisPur Ni-NTA Resin蛋白纯化树脂 美国Thermo Fisher公司；BCA蛋白定量试剂盒 默克生命科学；鼠抗组氨酸抗体、山羊抗鼠抗体 北京中杉金桥生物技术有限公司；脱脂奶粉 美国BD-Difco公司；9018型酶标板 美国康宁公司。

1.2 仪器与设备

5417R小型台式冷冻离心机 贝克曼库尔特公司；BSO-130011A2超净台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；HNY-2102C全温振荡培养箱 武汉瑞华仪器设备有限责任公司；M200 PRO酶标仪 瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 噬菌体LPST144 gp38序列理化性质、二级结构和遗传进化分析

通过在线工具ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）预测gp38序列的理化性质，包括等电点、不稳定系数和亲水系数；使用软件DNAMAN作多序列比对；使用NCBI CDD和Pfam数据库预测序列保守结构域；通过在线工具PredictProtein（https://www.predictprotein.org/）预测gp38序列的二级结构；利用NCBI BLAST工具查找GenBank数据库中与gp38具有相似性的序列，并使用MEGA7绘制进化树（Tree method：Maximum likelihood；Max Seq Difference：0.85；Distance：Grishin）。实验涉及到的尾纤维同源序列包括：LPST144（QEP53513）；BP12A（YP_009303689）；phiSG-JL2（YP_001949790）；SH2（YP_009289339）；SH1（YP_009289339）；phiIBBPF7A（YP_004306354）；Pf-10（YP_009145638）；Ebrios（AVJ51925）；Kvp1（YP_002308420）；Patroon（QBQ72909）；fPS-21（SOO46777）；fPS-9（SOL37536）；fPS-19（SOO46422）；fPS-89（SOO46625）；vB_KpnP_NahiliMali（QEG13382.1）；fPS-10（SOO46575.1）；vB_KpnP_Sibilus（QEG12954.1）；fPS-59（SOO46827）；vB_KpnP_Emp27（QEG11854.1）；E-2（YP_009226215）；2050H2（ASZ79018）；phiYeO3-12（NP_052117）；T7（AAM43539）；13a（YP_002003979）；YpsP-G（AFK13534）；T3（NP_523342）；phiA1122（NP_848304）。

1.3.2 尾纤维基因orf38的克隆以及重组表达载体的构建

以噬菌体LPST144的基因组为模板，设计引物orf38F（5’-CGGGATCCCGATGGCACTTAAATT-3’）、orf38R（5’-CCGCTCGAGCGGATAGA-AGTAGTGAAT-3’）（下划线分别代表BamH I和XhoI酶切位点）扩增目的基因orf38。使用限制性内切酶BamH I和XhoI酶切扩增产物和质粒pSmart-I，参照TaKaRa公司的BamH I和XhoI说明书，配制酶切体系并选择最佳酶切条件。按照QIAquick Gel Extraction Kit操作说明书对酶切产物进行回收，根据T4 DNA连接酶的说明书，将目的基因与质粒pSmart-I的双酶切产物进行连接，构建重组表达载体，然后转化BL21感受态细胞。使用质粒提取试剂盒提取重组质粒后用EcoR I和XhoI进行双酶切鉴定，将酶切鉴定正确的重组质粒送至公司测序。

1.3.3 重组蛋白的表达和纯化

挑取阳性单克隆接种于含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37 ℃过夜培养。取1 mL转接于100 mL含卡那霉素的LB培养基中，37 ℃培养至OD600nm值为0.6～0.8左右。吸取1 mL未经诱导的菌液作为阴性对照，在剩余的菌液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）（终浓度1 mmol/L）诱导，将加入IPTG后的菌液分别按下列条件进行培养：16 ℃培养12 h，37 ℃培养12 h，16 ℃培养4 h以及37 ℃培养4 h。收集不同表达条件的样品，12 000 r/min离心15 min收集菌体。用10 mL的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）重悬菌体，超声破碎细胞（功率200 W），超声时间2 s，间隔2 s，总计40 min，之后12 000 r/min离心10 min收集上清液。分别取10 μL样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）验证表达情况。

取上述最佳表达条件下的上清液样品，采用HisPur Ni-NTA树脂亲和层析纯化目的蛋白，取1 mL亲和树脂装柱，镍柱用PBS平衡后，加入破碎后的上清样品过柱，分别使用含有50、300 mmol/L咪唑的PBS洗去杂蛋白，并洗脱目的蛋白。纯化后的目的蛋白透析处理，在0.01 mol/L PBS中，4 ℃过夜去除咪唑。将透析后的蛋白样品利用10 kDa超滤管浓缩，4 000 r/min低温离心30 min，弃去滤出液。将最终截留的蛋白样品分装置于-20 ℃保存，取5 μL进行SDS-PAGE检测。采用BCA蛋白定量试剂盒绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。

1.3.4 重组蛋白的活性检测

将宿主鼠伤寒沙门氏菌ATCC13311培养至OD600nm值为0.8～1.2，平板计数，离心收集菌体，用1 mL无菌PBS将菌体悬浮于离心管，终质量分数为0.4%的甲醛灭活，4 ℃过夜；将灭活后的菌体用无菌PBS洗涤4 次，并以无菌PBS调整菌浓度至107CFU/mL，取100 μL宿主菌和其他6 株不同血清型的沙门氏菌（鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、鼠伤寒沙门氏菌ST-8、鼠伤寒沙门氏菌UK-1、肠炎沙门氏菌SJTUF10978、肠炎沙门氏菌SJTUF10984、肠炎沙门氏菌10960）包被于96 孔板，同时包被100 μL 5 μg/mL沙门氏菌外膜蛋白、100 μL 107CFU/mL灭活后的金黄色葡萄球菌6538和大肠杆菌T10以及100 μL PBS对照，4 ℃过夜；加入300 μL 3%脱脂牛奶于37 ℃封阻2 h，用PBST（含0.05%吐温20的PBS）洗涤5 次后每孔加入100 μL 0.05 mg/mL的gp38蛋白（加100 μL PBS作为对照），37 ℃孵育1 h，再依次加入50 μL 0.2 μg/mL鼠抗组氨酸抗体（一抗）、50 μL 0.2 μg/mL山羊抗鼠抗体（二抗），每一步之间用PBST洗涤5 次。然后加入底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺在37 ℃显色15 min，最后加入50 μL 2 mol/L硫酸溶液终止反应，并在450 nm波长处测定吸光度。

1.4 数据处理

实验重复3 次，每次设3 个平行。运用GraphPad Prism软件进行绘图和分析，实验数据采用ANOVA进行Duncan差异分析（P＜0.05，差异显著）。

2 结果与分析

2.1 尾纤维蛋白gp38基本理化性质分析

利用ProtParam工具对gp38序列理化性质进行分析，gp38由646 个氨基酸组成，等电点为5.94。不稳定系数为22.37，亲水系数为-0.368。一般而言，不稳定系数小于40表明该蛋白较为稳定，亲水系数为负值表明该蛋白具有一定的亲水性。从图1可见，gp38的氨基酸中含量最高的是丙氨酸（A），占全部氨基酸的11.5%，甘氨酸（G）、苏氨酸（T）、缬氨酸（V）、精氨酸（R）和天冬酰胺（N）含量较高，占比在6.5%～9.4%之间，含量最低的是半胱氨酸（C），占全部氨基酸的0.5%。非极性氨基酸占比为39.8%，极性氨基酸的占比较高为60.2%，其中带正电荷的极性氨基酸（K+R+H）有82 个，占12.7%，带负电的极性氨基酸（D+E）有74 个，占11.4%，其余的极性氨基酸为233 个，占36.1%。

图1 噬菌体LPST144尾纤维gp38氨基酸组成Fig. 1 Amino acid compositions of phage LPST144 tail fiber gp38

2.2 尾丝蛋白gp38的遗传进化分析

将噬菌体LPST144 gp38的氨基酸序列与NCBI nr数据库做BLAST比对，根据比对结果，选择相似度较高的序列用于后续的进化分析。如图2所示，噬菌体LPST144与噬菌体BP12A单独聚为一簇，相似度最高、亲缘关系最近，而与其他噬菌体T7、T3等亲缘关系明显较远，表明噬菌体LPST144和BP12A的尾纤维在序列上与nr数据库中其他噬菌体的尾纤维具有明显的差异。

图2 噬菌体LPST144尾纤维gp38的遗传进化分析Fig. 2 Genetic evolution analysis of phage LPST144 tail fiber gp38

根据图2结果，选择亲缘关系不同的8 种噬菌体尾纤维（表1）进一步比对分析。如图3A所示，序列比对结果显示N端保守性较好，同时在该区域预测到两个保守结构域，分别是：1～261位尾纤维蛋白，CDD数据库索引号为cl28018；279～331位噬菌体尾部领状区域，Pfam数据库索引号为pfam07484；而C端序列变异度较大。据文献报道，噬菌体尾纤维的N端通常与噬菌体主体连接，C端负责结合宿主菌，宿主菌表面受体的多样性导致C端序列的多样性[26]。前期工作中鉴定了T7与LPST144同属于Teseptimavirus属，T7噬菌体的尾纤维gp17与噬菌体LPST144的尾纤维gp38的氨基酸序列相似度为41%，覆盖率为54.21%。Garcia-Doval等[27]于2012年对T7噬菌体尾纤维gp17 C端377～533位进行了结构解析，结果表明T7噬菌体gp17最后84 个氨基酸（470～553位）由8 个β-折叠结构（B～I）和无规卷曲组成，形成4 个主要环状结构（BC、DE、FG和HI环），构成T7噬菌体尾纤维尖端结构域的一个单体，是识别和结合宿主菌受体的关键序列。因此将这一部分区域进一步比对分析，结果如图3B所示，总体来看，LPST144与BP12A尾纤维序列匹配非常好，在这一区间内仅有两个碱基的差异，而与phiSGJL2、SH1、SH2和T7、YpsP-G、T3、phiA1122，分为3 组，组内各自匹配度较好，验证了图2进化分析的结果，另一方面，由于各组之间序列差异大，未找到整体的核心保守区。

表1 噬菌体LPST144尾纤维gp38的同源性分析Table 1 Homology analysis of phage LPST144 tail fiber gp38

噬菌体T7 gp17的C末端富含β-折叠的区域是受体识别结合关键区，目前已知其520位的天冬氨酸（D）突变为谷氨酸（E）后可裂解E. coliB，544位的缬氨酸（V）突变为丙氨酸（A）后可裂解E. coliK12[28]，高同源性噬菌体phiA1122尾纤维523位亮氨酸（L）突变为丝氨酸（S）后，其宿主谱也发生了改变[29]（图3B下划线标记处）。通过分析比较LPST144 gp38 C末端的二级结构，发现同样存在大量的β-折叠结构，推测这些富含β-折叠的区域可能与宿主表面受体的识别和结合有关。不同的是T7 gp17的金字塔结构和顶端结构之间由1 个α-螺旋结构连接，顶端结构由8 个β-折叠和无规卷曲结构组成，gp38的C末端由12 个β-折叠（a～n）结构组成，紧接的是1 个α-螺旋结构（o）。T7 gp17具有2 个半胱氨酸（C），不形成二硫键，gp38具有3 个半胱氨酸（C），预测结果显示同样未形成二硫键。另一方面，前期工作中已经鉴定了LPST144与BP12A属于两个不同的物种（未发表），理论上两者的宿主范围会有一定的差异，其gp38 C末端与噬菌体BP12A尾纤维C末端高度相似，仅有2 个氨基酸（533位和612位）的差异（图3B方框标记位点），推测这2 个位点可能是受体识别和结合的关键位点。

图3 噬菌体LPST144尾纤维gp38序列比对分析Fig. 3 Amino acid sequence alignment analysis of phage LPST144 tail fiber gp38

2.3 尾纤维基因orf38的克隆以及重组表达载体pSmart-I-gp38的构建

图4 重组质粒pSmart-I-gp38双酶切电泳图Fig. 4 Electrophoresis profile of recombinant plasmid pSmart-I-gp38 after double enzyme digestion

以噬菌体LPST144的基因组序列为模板，设计上下游引物扩增目的基因，使用限制酶BamH I和Xho I酶切扩增产物和pSmart-I空质粒，使用T4连接酶进行连接，构建重组表达载体pSmart-I-gp38。采用Xho I和EcoR I对重组表达载体进行双酶切鉴定，结果如图4所示，酶切产物中包括目的条带（约2 100 bp）和载体条带（约5 400 bp）。同时根据重组质粒的测序结果，表明基因orf38正确插入载体pSmart-I中，重组表达载体pSmart-I-gp38构建成功。

2.4 重组蛋白的表达和纯化

重组表达载体pSmart-I-gp38转化感受态大肠杆菌BL21后，使用IPTG诱导表达，并探究在不同诱导条件下的表达效果。从图5A可知，在80 kDa左右出现预期目的条带，目的蛋白为82.89 kDa。另外，37 ℃诱导4 h上清蛋白表达效果最佳，目的条带明显，杂带浅，因此确定选择37 ℃诱导4 h，并选择上清蛋白作为目的蛋白源进行纯化。重组蛋白纯化结果如图5B所示，可知在75～100 kDa之间出现目标条带，经BCA试剂盒定量测定其质量浓度为0.5 mg/mL。

图5 gp38蛋白的表达与纯化Fig. 5 SDS-PAGE profiles of expressed and purified gp38 protein

2.5 重组蛋白gp38的活性

将宿主沙门氏菌ATCC13311加入酶标板过夜，使其附着在酶标板上；脱脂牛奶封阻后加入gp38蛋白进行孵育；然后依次加入一抗、二抗和底物进行显色，加入浓硫酸终止反应，检测重组蛋白的结合活性。结果表明（图6），实验组（加gp38蛋白）的吸光度为0.94±0.02，极显著高于阴性对照（PBS代替gp38蛋白）的吸光度0.17±0.01，表明gp38蛋白具有受体结合活性。为进一步验证gp38蛋白的结合特异性，分别用大肠杆菌T10、沙门氏菌外膜蛋白、金黄色葡萄球菌6538和PBS代替宿主沙门氏菌ATCC13311作为对照组，并测试其他6 株不同血清型的沙门氏菌。如图7所示，对照组吸光度分别为0.58±0.03、0.56±0.01、0.59±0.03、0.53±0.005，实验组（包括宿主在内的7 株沙门氏菌组）的吸光度较各对照组明显更高，且gp38蛋白与大肠杆菌T10、金黄色葡萄球菌6538和外膜蛋白的结合较PBS无明显差异，表明LPST144尾纤维gp38具有特异的受体结合活性。

图6 重组蛋白gp38对宿主菌的结合活性Fig. 6 Binding activity of recombinant protein gp38 to host cells

图7 重组蛋白gp38的特异性结合活性Fig. 7 Specific binding activity of recombinant protein gp38

3 讨 论

沙门氏菌噬菌体LPST144是本实验室前期分离得到的1 株短尾科噬菌体，其吸附时间短，9 min便达到最大吸附量77.57%，具有用于沙门氏菌快速检测方法开发的潜力。通过测序分析，鉴定其与T7噬菌体同属于Teseptimavirus属，预测了其尾纤维gp38（发表中），本研究对其尾纤维进行了进一步的序列分析和活性鉴定。目前已知晶体结构信息的尾纤维或尾刺数量非常有限，现已有报道的RBPs晶体结构有短尾科噬菌体P22的尾刺gp9[30]、T4噬菌体的gp37[31]以及T7噬菌体的尾纤维gp17[27]，通过对LPST144 gp38进行序列分析，发现LPST144尾纤维gp38与T7噬菌体尾纤维gp17的N端序列具有较好的相似性，C端相似性却极差。并通过遗传进化、多序列比对和二级结构分析，发现其满足RBPs的以下特征：具有模块化的性质，N端保守性强而C端多样性大；C端富含β折叠结构；序列相似性低。将其C端序列与GenBank数据库比对，发现仅与BP12A的尾纤维具有较好的相似性，而与其他序列同源性不高。BP12A为1 株沙门氏菌噬菌体，GenBank登录号为KM366096，经基因组比较鉴定，其与噬菌体LPST144是2 个不同的物种，理论上宿主范围存在一定差异，而两者的尾纤维C端仅有两个位点（533位和612位）的差异，因此推测这两个位点可能是受体结合关键氨基酸。由于PDB数据库中缺乏能够满足同源建模要求的结构模板，而采用从头计算的方法预测得到的三维结构未能通过评估，因此未能得到gp38三维结构，而LPST144的尾纤维与其他噬菌体（除噬菌体BP12A）的尾纤维几乎没有相似性，因此未来有必要对其空间构象进行解析，为扩宽其宿主谱提供指导依据。

目前报道的常用于沙门氏菌检测的RBPs有短尾科噬菌体P22的尾刺gp9[17]和肌尾科噬菌体S16的尾纤维gp38[32]，本研究对短尾科噬菌体LPST144的尾纤维进行异源表达，验证了尾纤维gp38的特异性结合能力。在异源表达实验中，最初使用的表达质粒为pET28b，由于表达产物溶解性差形成包涵体，于是在后续的实验中采用了携带His标签和SUMO标签的促融表达质粒pSmart-I。实验结果表明，增加SUMO标签能显著提高目的蛋白的溶解性。通过考察确定最佳的诱导条件为37 ℃诱导4 h，纯化后测定其蛋白质量浓度为0.5 mg/mL。在目的蛋白结合能力的实验中，gp38蛋白加入后的吸光度较阴性对照明显提高，表明了gp38蛋白对于宿主菌具有较强的结合能力。在验证其特异性结合能力的实验中，发现gp38对于宿主菌以及其他6 株受试的不同血清型沙门氏菌较大肠杆菌T10、沙门氏菌外膜蛋白、金黄色葡萄球菌6538和PBS代替宿主菌对照组的吸附明显更强，而包被大肠杆菌T10、沙门氏菌外膜蛋白和金黄色葡萄球菌6538组与PBS代替宿主菌对照组无显著性差异，表明了gp38蛋白的结合特异性，相比于常见的酶联免疫吸附实验，实验结果中对照组的吸光度偏高，推测这种现象的产生可能是由于gp38重组蛋白N端的SUMO标签未切割所造成，产生了一定的非特异性结合。通常情况下，重组表达蛋白的活性受到表达条件（温度、pH值等）、表达菌株和表达过程中重组蛋白是否正确折叠等诸多因素的影响，因此，后期还有待对这样因素加以考虑并优化条件，针对这一问题进行改进。通常RBPs的宿主范围会与完整噬菌体颗粒相当或者更为广泛，沙门氏菌血清型众多，目前已分离鉴定2 600多种，同时可大规模测定gp38结合的宿主范围，以明确检测的对象范围。已知目前报道的用于沙门氏菌的分子探针P22 gp9和S16 gp38对部分其他血清型鼠伤寒沙门氏菌作了测试，而鼠伤寒沙门氏菌ATCC13311均未被测试，一般来讲，由于RBPs的序列差异大，且沙门氏菌血清型众多（目前已发现超过2 600 个沙门氏菌血清型），能够结合的宿主范围差异也会很大。另一方面，本实验是一个初步的功能验证实验，其目的在于证明gp38具有RBPs特异性结合活性，具有作为检测探针的潜力，后期课题组将进一步优化gp38重组表达和活性研究并开发检测方法。一般来说检测灵敏度是针对检测体系的建立，因此目前未能进行灵敏度的比较。

4 结 论

迄今为止，沙门氏菌感染仍然是世界范围内主要的公共卫生问题，每年沙门氏菌的感染事件给人类健康以及经济社会造成重大负担，噬菌体作为细菌的天敌，能够特异性吸附并侵染宿主菌，给沙门氏菌的检测提供了新的思路。本研究对短尾科沙门氏菌噬菌体LPST144的尾纤维基因orf38进行研究，预测了其序列和结构信息，通过异源表达纯化，验证了gp38具有特异性结合宿主沙门氏菌以及实验中其他受试沙门氏菌的能力，为开发基于噬菌体RBPs为分子探针建立沙门氏菌的检测方法奠定了实验基础，同时也为理解噬菌体与宿主菌的相互作用提供了依据。