静电纺丝在组织工程学中的应用进展

赵守进，刘哲鹏，付子让，陈灵钰

上海理工大学 医疗器械与食品学院(上海，200093)

0 引言

目前，静电纺丝纤维已成为一种新型的细胞支架，通过高压静电在电纺丝喷头和接收装置之间施加电场，可以获得尺寸从几百纳米到几微米不等的电纺丝纤维。获得的纺丝纤维无需进一步的处理，它的溶剂在电场作用下完全挥发。静电纺丝技术在组织工程系统中有着巨大的优势，而且静电纺丝操作简单，材料选择性广，在伤口愈合、术后抗黏连、引导骨再生和体内局部药物递送中有良好的发展前景。

组织工程领域试图从细胞、生物分子和支架3个方面来恢复或再生受损组织和器官的功能。组织工程支架可为因疾病、损伤或先天缺陷而受损的细胞提供生长所需的三维环境。静电纺丝的多功能性决定了其可以制备细胞支架。

1 组织工程学的作用

20世纪80年代，JOSEPH 和ROBERT教授首先提出组织工程学这一概念。从机体获取少量的活体组织，用特殊的酶或其他方法将细胞从组织中分离出来,并在体外进行培养扩增，然后将扩增的细胞与具有良好生物相容性和可降解性的生物支架按一定的比例混合，使细胞黏附在生物材料支架上形成细胞-材料复合物；然后将该复合物植入机体的组织或器官病损部位，随着生物材料在体内逐渐降解和被吸收，植入的细胞在体内不断增殖并分泌细胞外基质，最终形成相应的组织或器官，从而达到修复创伤的目的。在植入到病变部位后，生物材料支架所形成的三维结构为细胞获取营养、生长和代谢提供了一个良好的环境［1］。目前组织工程技术可应用于各种组织再生，如肌肉、骨骼、软骨、肌腱、韧带、人工血管和皮肤等；在生物人工器官的研发中也有所发展，如人工胰脏、肝脏、肾脏等；同时也可以运用于神经假体和药物传输等［2］。

常见的组织工程支架制备方式有自组装、3D打印、静电纺丝等。自组装是通过分子或组分在基于非共价键的相互作用下自发的组织或聚集为纤维的过程。虽然自组装方式在智能神经纳米支架方面取得了许多进展，但是其产生的不良反应较多，而且其形貌外观可控性较差［3］。3D打印是一种简单的材料工程方法，设计多样化，能够精准的复制设计结构，但是对材料要求较高，部分材料无法使用该方法，且微纳米级的3D打印设备价格高昂［4］。而与其他几种方法相比，静电纺丝可以制备出均匀连续的微米或纳米纤维，且制备方法简单，纤维尺寸可控，对于材料的要求不高，是一种良好的支架制备方式。

2 静电纺丝技术

静电纺丝技术最早出现于19世纪科学家FOLMHALS申报的一系列专利中，以乙酸纤维素为研究对象，详细阐述了溶液的性质对收集板上带电纤维的影响。由于基础知识的匮乏，该技术的研究进展十分缓慢。19世纪70年代，Taylor通过对电纺射流过程的研究发现，只有当纺丝头形成的锥体锥角为49.3°时，纺丝才能稳定喷出，并命名为“泰勒锥”。Simons发现纺丝纤维直径与溶液的浓度有较大关系，Baumgarten制备了丙烯酸树脂纤维，并考察了纤维直径与溶液黏度、溶液进料速度、环境之间的关系。2000年静电纺丝技术的研究进度得到空前的提升，Reneker小组利用该技术制备了20多种聚合物纺丝，其直径最低为40 nm，并且通过对静电纺丝机理的研究，提出了弯曲不稳定机理。

2.1 静电纺丝原理

静电纺丝技术是指聚合物在熔融或者溶解的状态下，通过高压静电场的作用，最终形成纤维的过程。当电场施加在纺丝针头时，高分子的表面在高压下产生大量静电电荷，纺丝头尖端的液滴在静电力的作用下克服其表面张力，形成泰勒锥。当电场继续增大到其临界值时，流体表面受到的静电力大于其表面张力，带电的液滴会从泰勒锥的顶端喷射出去，形成带电的直线射流［5］。这个临界值被称为临界电压，即形成射流的临界电压。由于外加电场的干扰，喷射出的直线射流会经过一个突然加速的过程。在此过程中纺丝液中的溶媒挥发或者熔融状态的高聚物冷却固化，最终形成了高分子纤维，纤维经过高度拉伸而发生细化，最后被接地的接收器收集。

2.2 影响静电纺丝纤维的因素

静电纺丝制备过程受到多方面因素的影响。①聚合物自身的性质：聚合物的分子量、溶液或熔融体的导电能力、溶液的黏度及表面张力等［6］；②实验参数：电场强度、溶液流速、纺丝头的直径和材质、纤维的接收距离、接收装置的材质等［7］；③环境参数：环境温度、湿度、空气流速等［8］，这些因素相互交织共同影响纺丝过程，进而对纺丝的形貌和结构产生影响。

3 静电纺丝在组织工程学中的发展

3.1 皮肤组织工程学

最初研究人员研究纤维结构对皮肤组织再生的影响。Choi等［4］考察了纺丝排列顺序对大鼠上皮细胞的再生的影响，结果表明，随着纺丝有序化的增加，肌动蛋白的生长更加迅速。体内研究表明，与随机电纺纤维对照组相比，定向排列的电纺纤维加速了伤口愈合和胶原纤维排列、血管化和再上皮化。材料的选择对皮肤再生也十分重要，与原始材料相比，壳聚糖与胶原蛋白或丝素蛋白混合能够更好地诱导细胞增殖和促进伤口愈合［9］。Ma等［10］将川芎嗪加入丝素蛋白电纺支架中，发现其具有促进伤口止血、抗炎的作用。为了改善电纺生物材料的机械性能，Tian等［11］将生物活性玻璃加入到电纺鱼胶原蛋白纳米纤维中。比纯鱼胶原蛋白纳米纤维具有更高的拉伸强度和抗金黄色葡萄球菌，能促进了人皮肤成纤维细胞的黏附和增殖。Xian等［12］制备了具有广谱抗菌活性的5种季铵盐壳聚糖电纺支架，具有良好的生物相容性，能止血、促进伤口愈合。

3.2 血管组织工程学

心血管疾病造成每年的死亡人数一直居高不下，血管移植是现在治疗血管疾病的常用方法，而临床上血管移植物往往供不应求。在这一前提下，许多组织工程师正在开发电纺可吸收的小直径血管移植物引导血管再生。一些研究小组在使用肝素和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)来减少血栓形成和改善内皮化并取得了显著成就。Huang等［13］采用同轴静电纺丝法制备了含肝素的聚乳酸-己内酯支架。当支架植入狗的股动脉时，肝素充当抗凝剂，用以改善血管通畅性。内皮祖细胞称为成血管细胞,在生理或病理因素刺激下,可从骨髓到外周血管参与损伤血管的修复。为了促进内皮祖细胞的增殖，Li等［14］通过乳液静电纺丝将VEGF包被到含肝素的支架中。并控释肝素和VEGF，该支架具有良好的抗凝血和促进内皮祖细胞增殖的作用。

为了进一步提高血管移植物的生物相容性，可以在电纺支架中加入天然聚合物。Yin等［15］将胶原和壳聚糖与P(LLA-CL)共混，并与P(LLACL)纺丝比较，发现胶原和壳聚糖组显著的促进了内皮细胞增殖，表明支架的生物相容性得到改善。Kuang等［16］通过同轴静电纺丝制备了双层血管移植物，其中内层含有肝素，外壳含有负载介孔二氧化硅纳米颗粒(mesoporous silica nanoparticles，MSN)的丹酚酸B(salvianolicacids B，SAB)。肝素和SAB可持续释放近30 d，它们协同促进人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)生长。Zhao等［17］通过相分离和冷冻干燥的方法制备聚乳酸-己内酯[poly(DL-lactide-ε-caprolactone)]，PLCL 单层支架、双层支架和三层圆柱形支架。经过1周细胞培养后发现，PLCL多层支架上的细胞增殖更加明显。这项研究表明多层支架具有潜在的血管组织工程应用前景。

3.3 神经组织工程学

神经损伤是一种全球普遍性疾病，影响着全世界数百万人，这种疾病可能会使人们患有认知运动或精神上的永久残疾，加重人们的生活负担，降低生活质量。近些年，人们通过电纺丝制备神经支架。由于材料的变化，纺丝神经支架已从简单的中空管演变成更复杂的结构，它被称为神经导管 (nerveguide conduit，NGC)［18］。简单的空心NGC为再生神经提供了生长的管腔，同时限制了周围组织的生长。选择正确的材料十分重要，它会影响神经再生的潜力。丝素蛋白已被证明具有生物相容性并能促进细胞增殖［19］。Xue等［20］通过静电纺丝法制备了丝素蛋白纤维支架作为神经导管进行手术移植，用于治疗大鼠周围神经损伤。手术12个月后，绝大多数导管降解并被具有神经样外观的组织取代，通过Walkway™步态分析系统获得对称和步行步态参数，用于综合评估狗的后肢运动功能，结果发现，与非移植组相比，移植组表现出更好的站立稳定性和运动机能，而移植组内部对比并没有显著性差异。这足以表明SF-支架促使受伤后肢的行为恢复几乎等同于自体移植物。

除了简单的神经支架能够诱导神经再生之外，神经生长因子(nerve growth factor，NGF)也能够促进中枢神经元和外周神经元的发育、生长、分化和成熟。NGF在维持正常神经功能、加速神经系统损伤修复等方面发挥重要作用。因此，Kui等［21］通过同轴静电纺丝将NGF掺入电纺纤维中以促进神经再生。在这项研究中，NGF从电纺支架中缓慢释放，并且能够保持活性超过60 d，这对其长期释放控制神经再生有着重要的意义。此外，与对照组相比，含有NGF的支架经过12周的体内释放，结果发现，含NGF的神经支架有效地促进了神经再生。Wang等［22］研究了NGF在PLGA壳层纤维中的应用，将所得定向收集的纺丝支架包裹在不锈钢棒上，并用尼龙丝密封形成NGC。将所得NGC移植在大鼠13 mm坐骨神经缺损处，修复12周之后，支架促进了神经再生，通过电生理学和肌肉重量测试显示，与未含有NGF生长因子的对照组相比，再生神经的功能恢复有明显的改善。这些研究表明，NGF在促进受损周围神经修复中起重要作用。

3.4 骨组织工程学

世界上由于骨感染引起的骨缺损发生率很高，因此对骨移植有巨大的临床需求［23］。自身骨移植被认为是修复骨缺损的最好方法，因为它具有显著的骨诱导和骨传导能力，且没有不良免疫反应。然而，自身骨和同种异体骨的临床应用都有很多的限制。因此，使用组织工程学来再生骨是一种很有前途的方法。骨组织工程支架应具有生物相容性、生物可降解性、生物活性以及对骨环境具有足够的力学性能。为了满足这些要求，以有机和无机杂化纳米纤维等复合材料为基础，负载了骨形态发生蛋白、转化生长因子-β3(Transforming growth factor-β3，TGF-β3)、血管内皮生长因子和银纳米颗粒等功能因子的纳米纤维支架成为当前的研究热点［24］。Ye等［25］将纤维支架切碎成小段，通过冷冻干燥、热交联等方法，形成三维类骨支架，并制成含有骨的主要矿物成分（纳米羟基磷灰石）的复合支架。然后将合成的骨形态发生蛋白 -2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）衍生多肽固定在表面，并在大鼠颅骨缺损模型中对支架进行体外和体内评估。实验结果表明，纳米羟基磷灰石和BMP-2的存在增加了干细胞成骨分化相关基因的表达，BMP-2肽的释放可维持21 d。与对照组相比，支架能够更好诱导骨分化。

在试图调节骨重建过程中，Yi等［26］设计了一种电纺支架，支架包被MSNs和阿仑膦酸钠，前者可加速骨形成，后者可抑制骨吸收。该支架可将骨愈合时间从12周缩短到4周。随着愈合持续到12周，该支架的骨成熟度评分几乎是没有MSNs和阿仑膦酸钠的对照组支架的2倍，并且骨血管化程度明显增加。这些结果表明，负载MSNs和阿仑膦酸钠的电纺纳米纤维支架调节了骨重建过程，并促进了血管形成，这为骨再生提供了充足的营养。

为了促进细胞黏附，Gutiérrez-Sanchez 等［27］采用静电纺丝法制备了含有淀粉的聚乳酸(polylactic acid，PLA)纳米纤维，并将精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-aspatic acid，RGD)肽吸附到表面。与对照组相比，RGD修饰的支架具有更好的细胞黏附性，显示出引导骨再生的潜力。

3.5 软骨组织工程学

软骨损伤一直是困扰着人们的大问题。运动创伤和人体衰老都会对关节软骨造成损伤，这些创伤会导致骨关节炎和关节疼痛等疾病。虽然自身移植可用于治疗轻微的损伤，但用于移植的软骨是有限的，而且自体软骨移植在治疗严重的软骨缺损时效果不佳。因此，使用电纺支架的组织工程方法是治疗轻微和严重软骨缺损以减少骨关节炎的一种很好的方案［28］。

为了研究PVA/CMC复合材料对支架网内孔隙形成和软骨组织发育的影响。Namkaew等［29］将聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)与羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose，CMC)复合，形成用于制备多孔支架的共聚物溶液。结果发现，在聚合物溶液中加入羧甲基纤维素可以调节支架的结构和溶胀能力。细胞接种后14 d，软骨细胞活性良好。表明PVA/CMC多孔支架可用于软骨组织修复，是一种具有潜力的支架。

除了关节软骨，其他用于治疗先天性缺陷、创伤或疾病的透明软骨再生的纺丝支架也正在研究当中。由于耳朵和鼻子透明软骨的独特形态，可以将静电纺丝与3D打印相结合，构建有利于透明软骨再生的支架形状。Chen等［30］开发了一种用于3D打印的墨水，该墨水由透明质酸和聚氧化乙烯(polyethylene oxidized，PEO)溶液和切碎的静电纺丝膜组成，静电纺丝包含PLGA/明胶。该支架可在30 s内快速恢复形状，可用于体内复杂软骨结构的再生。

4 展望

电纺为组织工程支架的制备提供了一个简单可靠的方法。目前，随着组织工程支架的发展，静电纺丝工艺也发生了许多新变化，衍生出同轴电纺丝、乳液电纺丝和动态液体电纺丝，而且可以将生物活性物质和信号分子包裹在纺丝内。此外，电纺可以与其他研究工艺相结合，如冷冻和3D打印，以创建具有复杂3D特征的纳米纤维支架。

各种各样的天然聚合物、合成聚合物和它们的混合物已经被用来制造电纺支架，并用于皮肤、骨、软骨、神经、血管等组织工程当中。已有数种电纺纤维支架商业化生产，用于治疗各种疾病。例如，广州美普林再生医疗技术有限公司开发了PLA纳米纤维药物产品，用于人体硬脑膜的再生，已在多年前就通过了欧洲CE和中国食品药品监督管理局（CFDA)认证。上海松利生物科技有限公司开发了用于治疗疝气的纤维蛋白原/PLCL纳米纤维疝贴产品，于2018年获得CFDA证书。山东汉方药业有限公司开发了一种用于伤口敷料的丝素/PLCL纳米纤维膜，也于2019年获得了CFDA证书。此外，仍有许多生物医学公司正在开发其他生物医学应用的纤维支架，在不久的将来，会有更多商业化的纳米纤维医疗产品面市，电纺和电纺纳米纤维支架的进一步发展为各种组织工程应用带来了希望，并可能改善世界各地患者的生活质量。

静电纺丝在未来的组织工程学中能够广泛地应用，其将来发展的重点有：①纺丝材料：高聚物种类繁多，通过对不同材料组合或者对材料进行功能化，可以获得更好性能的电纺材料。②纺丝产量：纺丝产量较低是一问题，完善静电纺丝各种参数，可以进行多通道电纺提高纺丝产量。