PRE-084预处理对缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡的影响

高启军，邓长金

急性ST段抬高型心肌梗死多为血管完全闭塞，持续性心肌缺血可以导致心肌细胞坏死，尽早开通闭塞血管恢复血流灌注可以降低心肌细胞坏死，是最有效的治疗方法[1]。但缺血后再灌注可因一系列原因出现心肌细胞损伤，引起心肌细胞凋亡，其发病机制较为复杂，目前还未完全阐明[2]。细胞凋亡是一种受基因调控的程序性细胞死亡，是心肌缺血再灌注损伤的主要原因[3]。在心肌缺血再灌注损伤中心肌细胞凋亡的可能作用机制包括活性氧大量生成、细胞内钙超载、线粒体损伤等，同时一些信号转导通路及调控基因也影响心肌细胞凋亡的过程。最重要的凋亡调控基因是Bcl-2 基因家族，而Bax和Bcl-2的相互作用又是其中最为关键的细胞凋亡调控因素。Bcl-2 抑制细胞凋亡，而 Bax 促进细胞凋亡。通过调节Bcl-2/Bax的表达来防止细胞凋亡，是治疗缺血再灌注损伤的方法之一。

Sigma-1受体是近几年研究的热点之一，在中枢神经系统和其他周边组织中广泛表达。这些受体与神经变性疾病、抑郁症、特发性疼痛和癌症有关，已成为治疗这些疾病的新靶点[4]。最近的研究表明，Sigma-1受体激动剂具有心肌保护作用[5-6]。目前Sigma-1受体激动剂的研究主要集中于抑郁合并心血管疾病，而且研究时间较长，多为干预1个月，但其对缺血再灌注损伤的影响尚不清楚。本研究通过建立心肌缺血再灌注损伤大鼠模型，观察Sigma-1受体激动剂PRE-084对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂 SD雄性大鼠，SPF级，体重220～250 g，由武汉大学动物实验中心提供，动物合格证号：SCXK鄂2015-0018。PRE-084购自美国stanta公司。

1.2 实验分组 将15只SD雄性大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、PRE-084组，每组5只。PRE-084组于手术前1 h给予1 mg/kg PRE-084；假手术组和缺血再灌注组给予等体积的生理盐水，均为腹腔注射给药，实施30 min缺血及24 h再灌注造模；假手术组只穿线不结扎。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型制作及样本获取 大鼠腹腔注射麻醉(10%水合氯醛3 mL/kg)，气管插管后连接上小动物呼吸机，设置频率为60次/min，潮气量为2 mL/100 g，在胸骨左侧开胸，结扎冠状动脉左前降支中上1/3处。观察到结扎点的远端心肌变苍白、心电监护提示ST段抬高为造模成功，缺血30 min后，松开结扎线，恢复冠状动脉灌注，观察约10 min后逐层缝合。再灌注24 h后再次麻醉大鼠，剪开胸腔后取出心脏，去除心房、右心室，将左室分为两块，一块放入4%多聚甲醛中固定，用于末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记测定法(TUNEL)检测心肌细胞凋亡，另一块放入-80 ℃冰箱中，择期行反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检查。

1.3.2 心肌细胞凋亡检测(TUNEL法) 凋亡细胞断裂的基因组DNA暴露的3′-OH可以连上荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜进行检测。将石蜡切片常规脱蜡至水处理后，按照试剂盒说明书进行染色。以 TUNEL 阳性细胞数量与同一视野心肌细胞总数的比值作为左心室心肌细胞凋亡指数(apoptotic index，AI)。

1.3.3 荧光RT-PCR 检测Sigma-1受体、Bcl-2、Bax mRNA水平 于冰上取约100 mg组织，于1 mL 预冷的Trizol中充分研磨，按 Trizol 说明书提取组织总 RNA，经 RNA 浓度和纯度测定后，进行逆转录。Sigma-1受体引物序列：正向引物5′- GCAGTGGGTGTTTGTGAACG-3′，反向引物5′- TCTCAGCCCAGTATCGTCCC-3′；Bax 引物序列：正向引物5′- TGAACTGGACAACAACATGGAG-3′，反 向引物5′- AGCAAAGTAGAAAAGGGCAACC-3′；Bcl-2 引物序列：正向引物5′- TTGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3′，反 向引物 5′- TTCAGAGACAGCCAGGAGAAATC-3′；β- 肌动蛋白(β-actin)引物序列：正向引物 5′- CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3′，反向引物 5′- TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3′。实时荧光定量PCR是在StepOneTMReal-Time PCR仪(Life technologies公司)上完成，每个样品均作3个复孔，使用SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒(TaKaRa公司)进行检测。

2 结 果

2.1 各组心肌组织TUNEL检测结果(见图1、图2) 按TUNEL试剂盒提供的方法检测凋亡细胞，假手术组凋亡细胞少，模型组可见大量凋亡细胞，PRE084组可见少量凋亡细胞。假手术组、缺血再灌注组、PRE-084组细胞凋亡指数分别为0.04±0.01，0.38±0.05，0.16±0.03，3组比较差异有统计学意义(F=138.20，P=0.001)。与假手术组相比，缺血再灌注组与PRE-084组凋亡指数明显增加(P<0.01)；与缺血再灌注组相比，PRE-084组细胞凋亡指数明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)。说明缺血再灌注损伤可引起心肌细胞凋亡明显增加，而PRE-084预处理能减少心肌细胞凋亡。

图1 3组荧光显微镜下心肌细胞凋亡情况

与假手术组比较，*P<0.01；与缺血再灌注组比较，#P<0.01。

2.2 3组大鼠心肌Sigma-1受体 mRNA表达比较 PRE-084组、缺血再灌注组Sigma-1受体 mRNA 表达水平较假手术组明显下降(P<0.01)，与缺血再灌注组比较，PRE-084组Sigma-1受体 mRNA 表达上升(P<0.01)。说明缺血再灌注可引起Sigma-1受体 mRNA表达下降，而PRE-084预处理能使Sigma-1受体 mRNA表达增加。详见表1。

2.3 3组大鼠心肌Bcl-2、Bax mRNA表达比较 3组大鼠心肌Bcl-2、Bax mRNA表达比较差异有统计学意义(P<0.01)。与假手术组比较，PRE-084组及缺血再灌注组Bax mRNA表达均上升(P<0.01)，Bcl-2 mRNA表达均下降(P<0.01)，与缺血再灌注组相比，PRE-084组中Bax mRNA表达明显下降(P<0.01)，Bcl-2 mRNA表达明显上升(P<0.01)。说明缺血再灌注可引起Bcl-2下降、Bax上升，相应的Bcl-2/Bax比值下降，促进细胞凋亡，而PRE-084预处理使Bcl-2上升、Bax下降，相应的Bcl-2/Bax比值上升，抑制细胞凋亡。详见表1。

表1 3组大鼠心肌Sigma-1受体、Bcl-2、Bax mRNA表达比较(±s)

3 讨 论

本实验通过建立大鼠心肌缺血再灌注模型，观察Sigma-1受体激动剂PRE-084对缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响；使用RT-PCR法测定Bax、Bcl-2及Sigma-1受体mRNA 表达。实验结果表明，在心肌缺血再灌注前应用PRE-084干预，可以抑制心肌细胞凋亡；PRE-084在心肌缺血再灌注中通过Sigma-1受体调控Bcl-2及Bax基因表达水平来干预心肌细胞凋亡。

心肌细胞凋亡是心肌在病理因素的作用下发生的主动而有序的程序性死亡。缺血再灌注损伤的发病机制是多因素性的，凋亡是再灌注损伤的主要致病机制之一[7]。当心脏处于超负荷或心肌缺血等病理状态时，可能诱发细胞凋亡[8]。心肌细胞是不可再生的细胞，心肌细胞凋亡会导致心肌收缩功能障碍。因此，抑制心肌细胞凋亡是减轻心肌梗死病人心肌损伤的有效途径之一。本实验研究表明，缺血再灌注损伤引起心肌细胞凋亡增多，而PRE-084预处理可减少心肌细胞凋亡。

凋亡是一种基因调控的程序性死亡，凋亡调节基因分为抑制凋亡基因和促凋亡基因。研究最多的凋亡调控基因是Bcl-2 基因家族[9]，其产物根据蛋白结构、功能不同分为抑制凋亡蛋白和促凋亡蛋白，抑制凋亡蛋白包括Bcl-2、Bcl-X、Mcl-1、Bcl-w，促凋亡蛋白包括Bid、Bax、Bak、Bad，抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白含量的多少决定对细胞凋亡调控的方向，其中Bcl-2和Bax的相互作用在细胞凋亡调控过程中起重要作用[10]，主要分布在内质网、细胞核模和线粒体膜。Bcl-2 和Bax对细胞凋亡的调控作用，不仅受其表达的影响，而且受到 Bcl-2/Bax 比值的影响，Bcl-2/Bax 比值升高抑制凋亡发生，降低则促进凋亡。研究表明，Bcl-2可在多处不同的层面抑制心肌细胞凋亡[11]，Bcl-2可抑制氧自由基的产生而降低氧自由基损伤；可以调节胞内细胞器的Ca2+而减轻钙超载；还可以抑制线粒体膜上通透性转换孔开放，从而抑制细胞凋亡；Bcl-2可直接和凋亡蛋白活化因子1(Apaf-1)结合，防止凋亡蛋白酶的激活；Bcl-2可与Bax结合形成二聚体，从而使Bax无法发挥促凋亡作用。而Bax作为Bcl-2的同源体，可抑制Bcl-2的作用，促进细胞凋亡。因此，可以通过干预Bcl-2/Bax的表达来阻断细胞凋亡，从而减轻缺血再灌注损伤。本实验结果显示缺血再灌注使Bcl-2表达明显下降，Bax表达明显上升；经PRE-084预处理后，与缺血再灌注组相比Bcl-2升高，Bax下降，Bcl-2/Bax比值上升，提示PRE-084降低细胞凋亡与调节Bcl-2、Bax有关。

本研究结果表明，PRE-084抑制细胞凋亡的机制可能为通过增加激动Sigma-1受体增加Bcl-2表达、抑制Bax表达有关，其具体作用机制还有待进一步研究。