一种黄曲霉毒素M1 快速检测试纸条检测性能的评估

周刚刚，邢 凯，王楚端

（1.国家知识产权局，北京 100088；2.北京农学院动物科学技术学院，北京 102206；3.中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193）

黄曲霉毒素（Aflatoxins）是天然产生的真菌毒素，是黄曲霉、寄生曲霉和特曲霉等真菌的次级代谢产物[1]，主要有黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2等20 多种，其中以黄曲霉毒素B1（AFB1）为主，是目前已知的致癌性最强的化学物质。黄曲霉毒素主要污染谷物（如玉米、大豆、小麦等）。根据FAO 调查，全球每年谷物的25%会受到不同程度的霉菌毒素污染[2]。黄曲霉毒素污染谷物后，会继续存在于谷物加工的食品、饲料及各类副产品中，其经动物体代谢后主要产物为黄曲霉毒素M1（AFM1）。以奶牛为例，其采食被污染的饲料后很容易在乳汁中残留AFM1，对人体健康造成严重危害。目前国内外均对AFM1的污染做出严格的残留限量（MRL）要求，其中尤以欧盟最为严格，其规定牛乳中AFM1的MRL 为50 ng/L[3]。

目前检测AFM1的主要方法有酶联免疫法[4]、液相色谱质谱联用法[5]、胶体金免疫层析法[6]等，其中以胶体金层析法最为方便，是奶站、牧场和基层检测中应用较为广泛的手段之一。由于AFM1限量要求高，对检测试剂性能要求也高，因此非常有必要对其性能进行充分验证，以确保满足实际生产检测需求。本研究即根据欧盟参考实验室方案CRL Guidelines 2010[6]对自制的AFM1检测试纸条的检测精密度、特异性、假阳性率和假阴性率、重复性、稳定性、样本差异影响、批间差异及试剂盒稳定性分别检测，并通过胶体金读数仪对检测数据分析，为相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 胶体金读数仪（TSR100，杭州奥盛仪器有限公司），孵育器（mini 型，杭州奥盛仪器有限公司），移液器（200 μL，大龙兴创实验仪器(北京)有限公司），牛乳分析仪（保加利亚LactoScan）；AFB1、AFM1及玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、赭曲霉毒素和伏马毒素标准品来自于Sigma，抗生素标准品来自于中监所和上海阿拉丁公司。

AFM1检测试剂盒（德国R-biopharM），AFM1检测试纸条由本单位自制（检测限为50 ng/L，批号为RB190101、RB190111 和RB190201）。

1.2 样本检测 牛奶样本由本单位收集，UHT 奶和巴氏杀菌奶采购自本地超市。牛奶样品不需要前处理。室温下，将AFM1检测试纸条放入奶样中5 Min 取出。结果可以通过胶体金读数仪定量读取和显色定性2 种方法读取。

1.3 精密度检测 将经过确认没有AFM1污染的牛奶样本（AFM1＜5 ng/L，以下简称空白奶样）用AFM1标准品添加5 个不同浓度（0、25、50、75、100 ng/L），每个浓度做20 个重复，用AFM1胶体金检测试纸条检测；50 ng/L 做60 个重复用胶体金试纸条检测，并用胶体金读数仪做定量分析，计算不同浓度检测结果。

1.4 特异性检测 根据欧盟对不同药物的MRL 要求，如表1 所示，将不同浓度的交叉反应物质添加至空白奶样中，然后用AFM1胶体金检测试纸条检测，并定量分析检测结果。

表1 特异性检测物质及添加浓度

1.5 假阳性率和假阴性率检测 将采集自不同牛场的101 份奶样和100 份奶站收集的奶样用自制的AFM1胶体金检测试纸条检测，并用AFM1ELISA 检测试剂盒对样本结果进行复核，计算试纸条检测的假阳性率和假阴性率。同时，用SPSS 22.0 计算2 种结果的相关性。

1.6 重复性检测 将空白奶样用AFM1标准品添加0、25、75、100 ng/L，然后用不同试纸条各检测10 次，计算不同测定间的变化来判定试纸条检测的重复性；同时将同一试纸条多次检测，以检测结果来评价试纸条读数仪的重复性。

1.7 稳健性检测 为了进一步确认试纸条的检测性能，通过变化样本来检测添加浓度为50 ng/L AFM1标准品的空白奶样，具体如下：对加样体积做适当调整（±10%），即由200 μL 调整至180、220 μL；对奶样的温度做出变化，测定冷藏后的4℃以及室温20℃；将牛奶离心脱脂后继续检测。通过3 种调整对比试纸条对样本条件变化的适应性。

1.8 样本差异影响 牛奶由于牛个体差异呈现出脂肪、蛋白、体细胞数等的差异，并且随着泌乳阶段的不同，其乳成分含量也会不同。通过乳成分分析仪对收集的奶样本分类，对比检测脂肪含量（＜2 g/100mL，＞6 g/100 mL），蛋白含量（＜3 g/100 mL，＞4 g/100 mL），pH（pH 6.0，pH 7.5）对检测结果的影响，将上述不同样本添加50 ng/L AFM1标准品，以胶体金试纸条检测，分析检测结果。

1.9 试剂稳定性 将检测试纸条保存于37℃加速老化，分别于第1、2、3、5、7、15、30、60 天抽取检测添加浓度为50 ng/L AFM1标准品的空白奶样，根据结果判定试纸条的稳定性。

2 结果与分析

2.1 检测性能 由表2 可知，奶样添加浓度小于欧盟MRL 50 ng/L 时，检测结果均小于50 ng/L，即试纸条可在欧盟MRL 水平准确检测奶样中的AFM1是否超标；添加AFM1浓度为50 ng/L 时，检测结果范围为36.3～68.2 ng/L，即定量检测时，超过36.3 ng/L 即可认为是阳性，需要进一步用仪器法确认。

对不同浓度的检测数据进一步分析可知，试纸条检测空白奶样（0 ng/L）AFM1时，平均值为5.969 ng/L，标准差为5.205 ng/L，根据CRL 2010 要求计算其定性检出限（Mean +3×SD）为21.58 ng/L，定量检出限（Mean+10×SD）为58.01 ng/L。

表2 不同添加浓度检测结果

2.2 特异性 如图1 所示，黄曲霉毒素M2添加浓度为50 ng/L 时，检出为平均值为43.1 ng/L，交叉反应为0.86%，其他药物交叉反应均小于0.5%。

图1 AFM1 试纸条特异性检测结果

2.3 假阳性率和假阴性率 以试纸条方法检出限（21.58 ng/L）为判定标准，对101 份奶样检测出阳性2 份，试剂盒检测为全部阴性，假阳性率为1.98%；100 份奶站收集的样本经检测其中有2 份阳性值大于检出限，试剂盒检测为全部阴性，假阳性率为2%；综合考虑试纸条的假阳性率为2%，假阴性率为0。同时发现，2 种方法的检测结果呈高度的正相关（R2=0.95，P＜0.05）。

2.4 重复性 由表3 可知，检出浓度为1～100 ng/L 时，检测结果变异系数为6.18%～16.81%。

表3 胶体金试纸条重复性的检测结果

如表4 所示，胶体金读数仪的重复性CV 在1.327%～11.556%。

表4 胶体金读数仪的重复性检测结果

综合判定，试纸条检测结果的CV 小于20%，可满足实际检测需求。

2.5 稳健性 对加样体积做±10%调整后的检测结果如表5 所示，加样量变化对空白样本的检测结果影响不大，对添加AFM150 ng/L 的样本，当加样量较大（超过220 μL）时，检测结果由部分样本变化较大，由此可推测过大加样量可能会影响检测结果。

表5 不同加样体积的检测结果

如表6 所示，其中4℃的奶样检测结果稍微偏低，20℃结果正常，表明试纸条试剂检测的奶样温度最好控制在20℃左右。

表6 不同奶样温度的检测结果

添加50 ng/L AFM1的全脂牛奶经2 600 g× 4℃离心10 min 前后检测，结果如表7 所示，脱脂前检测结果正常，而脱脂后检测结果偏高，表明脂肪含量变化对检测结果有一定影响。

表7 奶样脱脂处理的检测结果

2.6 样本差异影响 由图2 和图3 可知，不同类型的样本，空白样本检出值均小试纸条的理论检出限（21.58 ng/L），均为阴性；添加50 ng/L AFM1的样本，不同样本检出结果平均值也接近于50 ng/L，样本间差异较小，即试纸条的样本适应性良好。

2.7 试剂稳定性 检测试剂盒于37℃加速老化，分别于第1、2、3、5、7、15、30、60 天抽取检测添加浓度为50 ng/L AFM1标准品的空白奶样结果如图4 所示，随保存期限的增加试纸条检测值逐渐降低。在第15 天时，检测平均值降低至48.235 ng/L；保存至第30 天时，检测值为39.43 ng/L；以50 ng/L 的定性检出限来判定，试纸条在37℃至少可保存15 d。

图2 不同类型的空白样本检测结果汇总

图3 添加50 ng/L 的不同样本检测结果汇总

图4 37℃保存期检测结果汇总

3 讨 论

胶体金是一种具有一定尺寸，可以保持稳定胶体状态的贵金属纳米粒子[7]。胶体金试纸条方法是一种以胶体金为示踪物的快速免疫分析技术，具有简便、快速等优势，能满足现场检测的要求[8]。胶体金试纸条检测方法作为目前牧场、奶站及乳品加工企业应用最为广泛的检测手段，因其成本低、操作方便备受欢迎。欧盟、美国均对检测试纸条的标准及应用做出相应的规定。以欧盟为例，CRL Guidelines 2010[6]标题全称为“兽药残留快速筛选方法验证指南”，其主要是针对快速筛选方法的性能指标的评定和验证做出全面的规定，而具有ISO/IEC17025 资质的实验室可以进一步据此指南对方法做出评价，如法国标准协会AFNOR 就依此推出了NF Validation，联合其成员实验室对快速检测方法评价。本研究中，采用欧盟标准下的标准验证本试纸条的可靠性，检测能力满足欧盟MRL（50 ng/L）要求。

AFM1含量是奶制品检测中重要的检测项目，其结果直接关系到奶制品的质量安全。目前，酶联免疫吸附法（ELLSA）、液相色谱质谱联用法等方法是检测AFM1的主要方法[9]。ELLSA 方法是将抗体抗原反应的特异性和酶与底物显色反应的高效催化作用有机结合而成的分析技术，其检测成功的关键是获得特异性较高的高活性抗体。但是目前报道抗体在其特异性、敏感性以及稳定性上都有一定缺陷[10]。同时，由于牛奶中的组成比较复杂，包括糖类、脂肪、蛋白质等，容易影响ELLSA 方法中酶和抗体的活性。因此在使用不同来源ELLSA 试剂盒时候要进行科学的评价。高效液相色谱法（HPLC）法是目前国内外检测AFM1的重要方法，具有高效、灵敏、快速、准确、特异性强等优点[11]。但是该方法在样品前处理过程中方法较为复杂，不适合大批量样品的检测。同时检测过程中用到较多的有机溶剂，其对环境及操作者有一定的伤害可能性。鉴于胶体金试纸条方法具有操作简单、不添加任何其他试剂、检测时间短、结果可靠等优点，十分适合牧场、奶站等地方奶样的快速检测，为AFM1检测提供了新的方法。

4 结 论

通过对自制的AFM1快速检测试纸条检测性能、试剂稳定性及样本适应性等方面的研究，结果表明该试纸条检测性能良好，可对牛奶中的AFM1检测。本研究初步确定了试纸条满足了牛奶测定的基本要求，同时可也为相关研究提供一定参考。