潜阳合剂对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞MYH7、ACTA1、BNP mRNA及蛋白表达的影响

陈 婕，王肖龙

心肌纤维化是心血管疾病发展到一定程度后的共同病理结果，其主要发生机制是因为细胞外基质代谢紊乱、胶原过度沉积以及各种因素导致的心肌细胞和心肌成纤维细胞增殖。心肌纤维化与高血压、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、心力衰竭、心肌炎等心血管疾病的发生发展均密切相关[1-3]。有研究发现，肥厚型心肌病心肌纤维化与β-肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain，MYH7)基因突变有关[4]。MYH7的突变使粗肌丝和细肌丝的亲和力降低，心肌纤维张力下降，导致心肌收缩功能降低，心肌细胞出现代偿性的增殖，最终导致肥厚型心肌病心肌纤维化[5]。Reza等[6]发现骨骼肌肌动蛋白α1(ACTA1)的基因变异与扩张型心肌病心肌纤维化的发生有关。ACTA1基因突变会降低编码蛋白的分子力，使心肌细胞的收缩力下降，导致扩张型心肌病[7]。脑钠肽(BNP)主要在心室表达，因心肌纤维化导致心功能不全时BNP可快速合成释放入血，使血管平滑肌增生，抑制心肌纤维化，调节心脏功能。BNP是反映各心脏疾病导致心功能不全的一项重要指标[8]。

本课题前期研究发现，潜阳合剂可以通过降低血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)水平来控制血压和抑制心肌纤维化[9]。本实验根据前期实验的研究结果，以体外原代培养提纯大鼠的心肌细胞(RCM)为研究对象，通过测定心肌纤维化分子标志物MYH7、ACTA1、BNP的蛋白及基因表达，为进一步探讨潜阳合剂抑制心肌纤维化提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级健康成年雄性 Wistar 大鼠 12 只，体重 170～200 g，购自上海中医药大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK(沪)2016-0004。动物喂养标准合成饲料，实验前适应性饲养7 d。

1.2 中药制备 熟地黄、钩藤、女贞子、当归等药物组成，由上海中医药大学附属曙光医院药剂科提供，含生药1.15 g/mL，保存备用。

1.3 试剂 ACTA1(Bioss公司，bs-10966R)，BNP(Bioss公司，bs-2040R)，MYH7(Bioss公司，bs-10901R)，羊抗兔-HRP(biovol公司，BV-S8008)，ECL 化学发光试剂盒(CWBIO 公司，00051403)，Trizol Reagent(15596-026，invitrogen)，氯仿(AR，国药)，异丙醇(AR，国药)，75%无水乙醇(AR，国药)，DEPC H2O(750024，invitrogen)，逆转录酶SuperScriptⅢ Reverse Transcriptase(R250-01,invitrogen)，荧光染料SYBR Green I(CS7561，invitrogen)，Rnase Inhibitor(E00381，Fermentas)，oligo dT/Random primer/特异性引物(Oligo，invitrogen)，Platinum Taq DNA Polymerase(10966034，invitrogen)，100 mmol/L三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs，18427013，invitrogen)等。

1.4 仪器 Allegra 21R 台式高速冷冻离心机(美国BECKMAN公司)，台式高速离心机(德国SORVAL公司)，Gel Doc2000成像系统(美国BIO-RAD公司)，垂直电泳系统(美国BIO-RAD公司)，320-S pH计(美国Mettler Toledo公司)，AR5120电子天平(美国AHOΜS公司)，MultiTemp Ⅲ 恒温水浴锅(日本SANYO公司)，雪花状制冰机(日本SANYO公司)，超净工作台(中国苏净集团)，高速冷冻离心机(Neofuge13R，Heal Force)，生物安全柜(HFsafe 1200 A2，Heal Force)，荧光定量聚合酶链式反应(PCR)仪(CFX96TM Real-Time Systerm，Bio Rad)等。

1.5 实验方法

1.5.1 分离培养 Wistar 大鼠乳鼠心脏纤维细胞 取 1～3 d的 Wistar 大鼠乳鼠 12 只，75%乙醇皮肤消毒后剪开胸骨，迅速挤出心脏，快速剪下心脏置于装有1×磷酸缓冲盐溶液(PBS)培养皿中。待洗净后，将心脏组织迅速剪成 1 mm3的组织碎块。将碎块组织放入无菌离心管中，用1×PBS 清洗干净血迹，再将组织块放入 1×PBS 混合消化酶中(每次 1.5～2.0 mL)，在 37 ℃恒温水箱中进行消化，组织首次消化 10 min，重复操作，以后每次消化 5～7 min，消化 4次或5 次将上清吸出至 50 mL 离心管中加入培养基[DMEM+5%胎牛血清(FBS)+1%双抗]中终止消化，直至组织块消化基本完毕。再经 200 目无菌滤网过滤后置于离心管中，1 000 r/min 离心 10 min，弃上清，沉淀加培养液，细胞计数后种入培养瓶内，置于 37 ℃，5%二氧化碳(CO2)细胞培养箱中培养，差速贴壁1.5 h，弃上清后加入新鲜培养液继续培养48 h后再更换一次培养液继续培养，待心肌细胞融合率达到80%～90%后传代，取第二心脏纤维细胞作为研究细胞。

1.5.2 CCK-8(cell counting kit-8)法检测 CCK-8法检测AngⅡ诱发心肌细胞的增殖，摸索合适的潜阳浓度(拮抗AngⅡ的作用)。用 96 孔板每孔接种 4 000 个 心肌细胞，于第2天换无血清饥饿处理过夜，后换成 1%FBS 维持培养。将细胞分为空白组、AngⅡ组(800 nmol/L)、AngⅡ+潜阳合剂组(稀释1 000 倍)、AngⅡ+潜阳合剂组(稀释 2 000 倍)、AngⅡ+潜阳合剂组(稀释 4 000 倍)、AT1R抑制剂组(阳性对照组)，添加适量 CCK-8 溶液，用酶联免疫检测仪测定其光吸收值即 OD490值。观察潜阳合剂对细胞的毒性及拮抗 AngⅡ作用的最佳浓度。

1.5.3 分组 心肌细胞分成空白组、AngⅡ组(800 nmol/L)、AngⅡ+潜阳合剂组(稀释4 000倍)。

1.5.4 蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测MYH7、ACTA1及BNP蛋白表达 BCA 试剂盒蛋白定量后上样，10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离总蛋白，然后转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，1∶500 稀释MYH7、ACTA1及BNP蛋白抗体分别进行免疫蛋白印迹分析，使用 ECL 化学发光试剂盒显像，凝胶图像分析系统分析各蛋白条带灰度值，并以Actin 为内参标化各样品蛋白电泳条带的灰度值。

1.5.5 实时荧光定量聚合酶链式反应(q-PCR)检测MYH7、ACTA1及BNP mRNA表达 先进行RNA样品提取与质检后再调整RNA浓度，按照实验目的进行稀释RNA至统一浓度，然后进行RNA反转录程序，再将获得的q-PCR引物(见表1)与获得的cDNA模板进行q-PCR扩增，检测细胞中目的基因的表达水平，目的基因的表达使用相对定量法。ΔCT值=样本待测基因CT值-相应内参基因CT值；ΔΔCT值=各组ΔCT值-对照组ΔCT 值；各组待测基因的相对表达倍数值=2-ΔΔCT，以该值进行统计分析。

表1 各目的基因的引物序列

2 结 果

2.1 不同浓度的潜阳合剂对AngⅡ诱导心肌细胞增殖的影响 用不同浓度的潜阳合剂处理后，CCK-8法检测OD值，潜阳合剂稀释1 000倍后，对心肌细胞无毒性(见表2)。800 nmol/L AngⅡ处理后出现心肌细胞增殖，加入潜阳合剂后，稀释4 000倍时能很好地拮抗 AngⅡ的作用(见图1)。

表2 CCK-8 法检测潜阳合剂对心肌细胞毒性(OD490值)

图1 不同浓度潜阳合剂对AngⅡ诱导心肌细胞增殖的影响

2.2 3组MYH7、ACTA1及BNP蛋白表达比较 与空白组比较，AngⅡ组MYH7、ACTA1及BNP蛋白表达明显上升(P<0.05或P<0.01)；与AngⅡ组比较，AngⅡ+潜阳合剂组MYH7、ACTA1、BNP蛋白表达明显下降(P<0.01)。详见表3、图2。

表3 3组MYH7、ACTA1及BNP蛋白表达比较(±s)

图2 Western Blot检测MYH7、ACTA1、BNP蛋白表达电泳图

2.3 3组MYH7、ACTA1及BNP mRNA表达比较 与空白组比较，AngⅡ组MYH7、ACTA1、BNP mRNA表达均明显升高(P<0.01)；与AngⅡ组比较，AngⅡ+潜阳合剂组MYH7、ACTA1、BNP mRNA表达降低(P<0.05或P<0.01)。详见表4。

表4 3组MYH7、ACTA1及BNP mRNA表达比较(±s)

3 讨 论

各种慢性心血管疾病的最终病理改变是以心肌纤维化为特征的心肌组织异常重构[10]。但各心血管疾病致心肌纤维化的具体机制尚不明确。目前研究发现肥厚型心肌病基因突变的35%～50%是MYH7基因突变，是我国肥厚型心肌病病人所致心肌纤维化的主要突变基因，也是主要的恶性突变基因[5，11]。心肌细胞肥大以及间质纤维化也是扩张型心肌病的主要病理变化。李峥等[12]发现心肌细胞中ACTA1基因突变可导致其编码的蛋白结构改变，从而造成心脏收缩传导障碍。BNP是公认的各心血管疾病终末期心肌纤维化所致心功能下降的评估指标，能反映其疾病的预后。BNP值越高则预后越差。所以，心肌细胞肥大、心肌纤维化与MYH7、ACTA1、BNP密切相关。现代医学发现血管紧张素转换酶抑制剂、AngⅡ受体拮抗剂、钙离子拮抗剂(CCB)、醛固酮拮抗剂可以改善心血管疾病所致心肌纤维化的进展和预后，但总体效果有待进一步提高[13]。近年来，中药治疗心肌纤维化成为热点并取得一定成效。

潜阳合剂是上海中医药大学附属曙光医院研制的院内制剂(沪药制字Z05100449)，是我院治疗高血压的验方。潜阳合剂主要由熟地黄、钩藤、女贞子、牡蛎等药物组成。诸药均归肝经，可疏肝平肝；熟地、牡蛎归肾经，可滋肾阴、制肝阳。该方以熟地黄、钩藤、女贞子为君药滋阴补肾、平肝潜阳；蒺藜为臣药，增强平肝、滋阴之功效；佐以牡蛎补阴潜阳；当归补血活血，提高君药补血滋阴的疗效。前期研究发现，潜阳合剂不仅可以降低血压，而且可以抑制血管壁胶原蛋白的合成，改善自发性高血压大鼠的胸主动脉肥厚性重构，还发现潜阳合剂可以通过降低Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维的沉积改善高血压左室肥厚的心肌重构[14]。因此，潜阳合剂可以改善心肌纤维化所致的心肌重构。

本次实验在前期研究的基础上假设潜阳合剂改善心肌纤维化与MYH7、ACTA1、BNP的蛋白及基因表达有关，结果发现：潜阳合剂能够通过降低AngⅡ诱导心肌细胞后MYH7 mRNA的表达，下调MYH7、ACTA1、BNP蛋白及ACTA1、BNP mRNA表达来抑制心肌细胞肥大及纤维化的发生发展。本实验研究为今后潜阳合剂改善心肌纤维化提供了科学依据和新的思路。