艾拉莫德对调节性B细胞及相关细胞因子的影响

孙蛟,丛珊,李潭,张倩楠,罗莉

作者单位： 830011 乌鲁木齐市,新疆医科大学第一附属医院风湿免疫科

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以持续性关节滑膜炎性反应导致骨和软骨破坏为特征的慢性系统性全身性自身免疫性疾病[1]。T细胞免疫功能紊乱是RA发病的主要机制之一[2]，但近年，具有负向免疫调节、维持免疫平衡的调节性B细胞(Bregs)也成为RA发病的研究热点[3]。艾拉莫德是我国自主研发的1.1类药物，是一种新型的具有多作用靶点的抗风湿药物(DMARDs)，对RA有明显的治疗作用[4]。研究表明，艾拉莫德不仅对Th1、Th17细胞有抑制作用[5-6]，且能降低B细胞分泌的免疫球蛋白和红细胞沉降率[7]。艾拉莫德是否通过影响Bregs从而达到控制关节炎症的目的尚未明确。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择健康清洁级、6～8周龄、Wistar雌性大鼠60只，平均体质量180～220 g。

1.2 实验药物与试剂 艾拉莫德片(先声药业有限公司生产，国药准字H20110084)；牛Ⅱ型胶原(美国Chondrex公司生产，生产批号：20022)、弗氏完全佐剂(美国Sigma公司生产，生产批号：F5881)；大鼠白介素-10(IL-10)、转化生长因子-β(TGF-β)ELISA试剂盒(武汉基因美科技有限公司生产，生产批号GR201708-1)。

1.3 方法 (1)动物分组：将60只大鼠随机分为空白组、CIA模型组、艾拉莫德组，每组20只。(2)模型制备：将牛Ⅱ型胶原等体积加入弗氏完全佐剂后，于冰浴条件下使二者充分乳化[4]，CIA模型组和艾拉莫德组大鼠足跖及尾根部采用多点皮内注射的方法进行初次免疫，0.3 ml/只，初次免疫第8天，再次制备上述乳剂，进行加强免疫。免疫后第21天时，关节炎指数(AI)≥6分提示造模成功[8]。(3)治疗方法：造模成功后，艾拉莫德组给予每只大鼠每天灌胃艾拉莫德10 mg·kg-1·d-1，模型组给予每只大鼠每天灌胃等量生理盐水，给药4周。

1.4 观察指标 (1)大鼠体质量变化：测体质量，每4天1次，直至治疗结束。(2)滑膜病理变化情况：HE染色，光镜下观察滑膜细胞和血管的增生及淋巴细胞浸润等情况。(3)ELISA法检测细胞因子：末次治疗24 h后，取大鼠血液离心后采血清，使用ELISA方法检测IL-10、TGF-β的表达水平。(4)实时荧光定量PCR测定：末次治疗24 h后，获取滑膜，提取滑膜总RNA，鉴定总RNA纯度和浓度，反转录合成cDNA，进行引物设计和合成，最后进行Realtime PCR。

2 结 果

2.1 大鼠体质量比较 治疗前，3组大鼠体质量比较差异无统计学意义(P>0.05)；治疗第57天，艾拉莫德组大鼠体质量大于治疗前和CIA模型组，但低于空白组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠治疗前后体质量比较

2.2 滑膜组织病理形态学检查 空白组大鼠关节滑膜有4层细胞层且未见炎性细胞浸润；CIA模型组关节滑膜有10层细胞层，可见大量炎性细胞浸润；艾拉莫德组有4层细胞层，未见明显炎性细胞浸润。见图1。

注：a为空白组；b为CIA模型组；c为艾拉莫德组图1 关节滑膜病理光镜切片 (×400)

2.3 ELISA法检测细胞因子变化情况 与空白组比较，CIA模型组和艾拉莫德组血清IL-10、TGF-β表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与CIA模型组比较，艾拉莫德组血清IL-10、TGF-β表达无明显变化(P>0.05)。见表2。

表2 各组细胞因子表达情况比较

2.4 Realtime PCR测定细胞因子变化情况 与空白组比较，CIA模型组和艾拉莫德组关节滑膜IL-10mRNA、TGF-βmRNA及脾脏Bcl-6mRNA表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与CIA模型组比较，艾拉莫德组关节滑膜IL-10mRNA、TGF-βmRNA及脾脏Bcl-6mRNA表达无明显变化(P>0.05)。见表3。

表3 各组关节滑膜IL-10mRNA、TGF-βmRNA及脾脏Bcl-6mRNA表达比较

3 讨 论

RA是以侵蚀性、慢性、全身性多关节炎为主要表现的自身免疫性疾病。目前认为，RA的发病机制可能与免疫活性细胞、异常的抗原提呈细胞、抗原特异性T细胞、B细胞和自身抗体(如类风湿因子、抗环瓜氨酸肽抗体等)之间的相互作用有关[9]。虽然T细胞免疫功能紊乱是RA发病的主要机制之一[2]，但维持机体免疫耐受[10]、发挥免疫调节作用、通过直接接触(Fas L、PD-L1)、间接接触(主要分泌IL-10、TGF-β)发挥免疫效应，其中Bcl-6为标志性转录蛋白[11-13]，这类具有特殊功能的B细胞亚群被称之为Bregs[14]，这也是近年RA发病机制的研究热点。亦有研究指出，分泌IL-10的Bregs细胞在RA患者和其他炎性疾病的免疫调节功能中发挥核心作用[15]。因此，Bregs在RA的发生发展中起着极其重要的作用。

大部分治疗RA的药物的作用机制为抑制机体T细胞的增殖，如甲氨蝶呤片、来氟米特片等。而艾拉莫德是我国自主研发的1.1类新药，已被亚太抗风湿病联盟(APLAR)纳入治疗RA。艾拉莫德通过T细胞途径减少IL-1β、TNF-α的分泌，通过临床观察，也降低免疫球蛋白、红细胞沉降率，说明其可改善B细胞的免疫功能，在RA的治疗中发挥作用。研究表明，Bregs亦可调控免疫球蛋白的类别转换[16]。本研究旨在探讨艾拉莫德是否通过调控Bregs途径促进IL-10、TGF-β、Bcl-6的表达，从而达到控制关节炎症的作用。

本实验使用艾拉莫德治疗Wistar大鼠CIA模型，结果显示，CIA模型组及艾拉莫德组与空白组比较，大鼠体质量增加缓慢。经艾拉莫德治疗后，CIA大鼠关节肿胀逐渐消退，在实验第57天，CIA大鼠体质量明显增加，经HE染色发现，CIA大鼠关节滑膜有4层细胞层，炎性细胞浸润明显减少。本结果表明，艾拉莫德可明显改善CIA大鼠关节肿胀、使体质量增加恢复正常、关节滑膜细胞层恢复正常，这与Lina等[17]研究结果一致：艾拉莫德在RA动物模型中具有较强的抗炎和改善关节炎症状的功效。

本研究通过与空白组比较，ELISA法检测发现CIA模型组血清IL-10、TGF-β表达水平降低，PCR荧光定量发现关节滑膜中IL-10mRNA、TGF-βmRNA及脾脏Bcl-6mRNA表达降低，与Johansson等[18]研究结果一致。Bregs分泌的IL-10、TGF-β、Bcl-6在RA的发生发展中起到重要作用[19]。与CIA模型组比较，ELISA法检测发现艾拉莫德组血清IL-10、TGF-β表达水平未见明显变化，PCR荧光定量发现关节滑膜中IL-10mRNA、TGF-βmRNA及脾脏Bcl-6mRNA表达未见明显变化，研究结果提示，艾拉莫德并未影响IL-10、TGF-β、Bcl-6的表达，说明艾拉莫德不是通过影响IL-10、TGF-β、Bcl-6这条途径来控制关节炎症。

综上所述，Bregs有不同的类型，表型各异，根据表型的不同分为过渡2型边缘带前Bregs、MZBregs和分泌IL-10的B10细胞等。本研究完成了CIA大鼠血清及滑膜中细胞因子IL-10、TGF-β及标志蛋白Bcl-6的检测，因艾拉莫德对免疫球蛋白有抑制作用，艾拉莫德是否通过影响过渡2型边缘带前Bregs或MZBregs控制关节炎症将是下一步的研究重点。