苦郎树组培快繁技术研究

刘德浩，陈智涛，邓仿东，王少东，舒夏竺，黄竞中，廖文莉

（惠州市林业科学研究所，广东惠州 516001）

苦郎树（Clerodendrum inerme）为马鞭草科（Verbenaceae）大青属攀援状灌木，直立或平卧，高可达2 m，自然分布于热带和亚热带的海岸、河滩和潮汐地，在园林绿化中是很有价值的地被植物或树篱植物，也是沿海防护林的优良树种[1-4]。苦郎树的枝和叶入药可用于治疗跌打损伤、血瘀肿痛、疮癣疥癞和湿疹瘙痒等，根部能分离出具有镇痛和抗菌作用的糖酐酯[5-7]；也是一种常用的苦味补药。其临水生长，种子收集困难。本研究对苦郎树的茎段组织培养技术开展研究，以期建立苦郎树完整的离体快繁技术体系，为其规模化育苗提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料来源于惠州市惠东县铁涌镇野外收集的3年生苦郎树种子实生苗，选取当年新抽出的半木质化枝条作为外植体材料[8]。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体灭菌

选取生长健壮且长势良好的苦郎树实生苗枝条，去除叶片后带回实验室进行预处理。首先将选取的苦郎树枝条修剪成10 cm长的茎段，放在流水下冲洗2 h，然后放入超声波清洗机中用0.2%灭菌净清洗20 min，最后用无菌水冲洗5 次，备用。在超净工作台上，以75%酒精和0.1%氯化汞HgCl2作为消毒剂进行不同消毒处理，之后用无菌水冲洗5次，将灭菌后的外植体接种至MS培养基中。共12个处理，每处理接种10 个茎段，3 次重复。接种20 天后统计污染率和萌发率。

1.2.2 基本培养基的筛选

在合适的灭菌处理基础上，将灭菌后的苦郎树茎段分别接种至MS、1/2 MS 和1/4 MS 培养基中，每5天统计1次外植体褐化率，筛选出适宜外植体生长的基本培养基。

1.2.3 初代培养

在基本培养基上，进行不同浓度6-BA（0.5、1.0和1.5 mg/L）、NAA（0.05、0.10 和0.15 mg/L）和IBA（0.5、1.0和1.5 mg/L）的正交试验，探究不同类型和浓度的植物生长调节物质对苦郎树丛生芽诱导的影响。共9个处理，每处理10瓶，每瓶接种3个茎段。

1.2.4 继代培养

在1/2 MS 培养基上，进行不同浓度6-BA（0.5、1.0、1.5 和2.0 mg/L）和NAA（0.05、0.10和0.15 mg/L）的激素处理。共12个处理，每处理10瓶，每瓶接种3个茎段。接种30天后统计增殖倍数，并观察生长情况。

1.2.5 生根培养

切取生长健壮的芽苗接种至生根培养基中。以1/2 MS为基本培养基，添加不同浓度的NAA（0、0.05、0.10、0.15 和0.20 mg/L）。共5 个处理，每处理10 瓶，每瓶接种3个芽苗。接种30天后统计生根情况。

1.2.6 培养条件

初代培养、继代培养和生根培养的培养基均附加25 g/L 蔗糖和6 g/L 琼脂粉，并调节pH 值为5.8。培养温度为25 ℃，光照强度为2 000 lx，光照时间为每天12 h。

1.2.7 炼苗与移栽

完成生根培养后，选取生长健壮的生根植株，在荫棚内炼苗10 天。洗净幼苗根部的培养基后移栽至预先进行了消毒处理的珍珠岩、泥炭土和沙子（2∶2∶1）混合基质中。30天后统计幼苗成活率。

1.3 数据处理

污染率=（污染数/接种数）×100%

萌发率=（产生愈伤组织数/接种数）×100%

诱导率=（未污染外植体产生愈伤组织数/未污染外植体总数）×100%

采用Excel 2007 和SPSS 21.0 软件进行数据统计分析，采用Duncan，s 新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同消毒方法对外植体灭菌效果的影响

随着75%酒精和0.1% HgCl2处理时间的增加，苦郎树外植体污染率逐渐下降（表1）。酒精处理30 和60 s 的外植体污染率均显著低于未经酒精处理的外植体（P＜0.05），0.1% HgCl2处理7 min 的平均萌发率最高。最佳灭菌方式为处理6（75%酒精处 理30 s 和0.1% HgCl2处 理7 min），污染率为16.67%，萌发率为73.33%。

表1 不同消毒处理对苦郎树外植体的影响Tab.1 Effects of different disinfection treatments on explants of C.inerme

2.2 基本培养基的筛选

1/2 MS 培养基中外植体的褐化率明显低于MS和1/4 MS 培养基，对愈伤组织的诱导率（76.67%）显著高于其他两种培养基（P＜0.05）（表2）。将外植体接种至1/2 MS 培养基的第12 天能观察到侧芽萌发。因此，选用1/2 MS 培养基作为外植体侧芽诱导的基本培养基。

表2 基本培养基的筛选Tab.2 Screening of basic medium

2.3 初代培养

以1/2 MS 为基本培养基，进行不同浓度6-AB、NAA 和IBA 处理（表3）。结果表明，处理6 的平均丛生芽数为3.52 个，平均芽长为2.12 cm，平均叶片数为5.26 片，诱导率为90.00%，所有指标均表现最好。因此，选择处理6 为苦郎树适宜的初代培养基，即1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA。

表3 生长调节物质对苦郎树外植体丛生芽形成的影响Tab.3 Effects of growth regulators on cluster bud formation in explants of C.inerme

2.4 继代培养

将初代诱导出的丛芽接种到增殖培养基中，添加不同浓度的6-BA 和NAA 进行继代培养。结果表明，12 个处理的增殖倍数为2.9 ～4.2（表4）。处理8的增殖倍数最高（4.2），继代培养出的小芽生长健壮且茎粗壮。因此，选择处理8为苦郎树适宜的继代培养基，即1/2 MS+1.5 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA。

表4 不同激素处理对苦郎树萌芽增殖的影响Tab.4 Effects of different hormone treatments on multiplication of C.inerme

续表4 Continued

2.5 生根培养

随着NAA 浓度的增加，苦郎树小芽的生根率呈先增加后下降的趋势（表5）。处理3 的平均根数最多，平均生根率最高。其他处理均不适宜炼苗移栽。因此，选择处理3为苦郎树适宜的生根培养基，即1/2 MS+0.10 mg/L NAA，平均根数为3.50条，平均生根率为93.33%，且根系粗壮。

表5 不同激素处理对苦郎树生根的影响Tab.5 Effects of different hormone treatments on rooting of C.inerme

2.6 炼苗与移栽

选择生长健壮、根系发达且粗壮的植株置于荫棚内炼苗，逐步打开瓶盖，在瓶苗逐渐适应外界生长环境后，移栽至预先进行了消毒处理的珍珠岩、泥炭土和沙子（2∶2∶1）混合基质中（图1G）。30 天后的移栽成活率为100%，且植株生长良好，须根数量有所增加。

图1 苦郎树组织培养与移栽Fig.1 Tissue culture and transplanting of C.inerme

3 结论与讨论

苦郎树茎段外植体用75%酒精处理30 s 和0.1% HgCl2处理7 min，能有效灭菌；最佳诱导培养基为1/2 MS + 1.0 mg/L 6-BA + 0.15 mg/L NAA +0.5 mg/L IBA，最佳继代培养基为1/2 MS + 1.5 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA，最佳生根培养基为1/2 MS+0.10 mg/L NAA，生长健壮的植株移栽至珍珠岩、泥炭土和沙子（2∶2∶1）混合基质中长势良好。

建立植物离体快繁体系的前提是能获得有活力的无菌材料。植物离体培养中的污染源一方面来自于组培过程中的不规范操作，另一方面来自植物的内生菌。组培过程中人为因素造成的污染目前已得到有效控制，但植物内生菌的污染难以彻底清除[9-10]。本试验结果表明，在消毒灭菌过程中，酒精和HgCl2相结合的灭菌处理效果好，由于酒精具有较强的渗透性，容易对外植体的活性造成不可逆伤害，所以在灭菌过程中需严格控制酒精的灭菌时间。

由于植物内源激素无法满足离体组织增殖和生根的需要，因此在组织培养过程中，需要添加适宜的外源植物生长调节物质，这是促进愈伤组织形成、芽的分化以及不定根形成的重要手段之一[11]。NAA和6-BA 对苦郎树丛芽生长作用显著，但高浓度6-BA容易导致苦郎树的外植体褐化严重并抑制侧芽形成。本试验建立了苦郎树离体培养体系，对苦郎树种质资源的保存以及规模化育苗具有重要意义。