驻景丸治疗糖尿病视网膜病变网络药理学研究

薛 屹，孙向明，胡 扬，刘博男，宋 辉，凌 娜，李文兰*

(1. 哈尔滨商业大学 药学院，哈尔滨 150076；2. 哈尔滨商业大学 药物工程技术研究中心，哈尔滨 150076)

糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy，DR)是常见的糖尿病并发症之一，发病取决于糖尿病患者血压、血脂、血糖水平的控制情况，患病时间的长短以及糖尿病的类型等，其病变发展迅速，是糖尿病患者视力受损甚至失明的主要原因[1-3].DR按视网膜微血管逐渐发生病变情况可广泛分为非增殖期和增殖期.增殖期新生血管增生，破坏视网膜微血管系统，严重时伴有黄斑水肿，导致视网膜脱落甚至失明，严重影响患者的健康和生活质量.目前DR的病因尚不明确且治疗效果有限，因此，DR的机制及其潜在有效治疗方法受到广泛的研究[4].

驻景丸出自宋代官修方书《太平圣惠方·卷第三十三·治目昏暗方》[5].原方由菟丝子5两(酒浸3日，晒干，别捣为末)，车前子1两，熟干地黄3两组成.其中，菟丝子与熟地黄皆归于肝、肾经，两者均具有补益肝肾、益精养血的功效.车前子归肝、肾、肺、小肠经，有清热明目，利尿通淋的功效[6].肝开窍于目，菟丝子、熟地黄补益肝肾精血以滋养双目.肝肾阴虚，痰浊血瘀，浊邪害清，导致眼生翳障，视物昏花[7].车前子分清浊，利水湿，导浊水下往膀胱，可清肝热而明目[8].三者配伍可治疗糖尿病视网膜病变，但其作用机制复杂，涉及神经炎症，氧化应激[4]，血管病变[9]等多个方面.网络药理学是一种综合多学科理论阐明药理机制的新方法，它通过对有效成分的筛选、靶标的预测和分子之间的相互作用机制来进行分析，为预测药物治疗疾病的潜在靶标和通路提供了可靠的研究背景[10].本文拟采用网络药理学的研究方法预测驻景丸治疗DR的潜在靶标及其可能的作用机制，为今后药理研究或药物研发提供新思路和参考.

1 材料与方法

1.1 驻景丸成分收集与筛选

以驻景丸全方中“菟丝子”、“车前子”、“熟地黄”为关键词在传统中药系统药理学分析平台TCMSP中查找所含所有成分.根据TCMSP平台推荐的药动学参数(Oral bioavailability，OB)≥30%，类药性(Drug-like index，DL)≥0.18 为限定条件进行筛选，同时结合文献报道，核查合并后得到驻景丸候选活性成分.

1.2 驻景丸活性成分的靶标预测

通过TCMSP数据库和SymMap数据库检索驻景丸中所筛选的活性成分的相关靶标，并通过 Uniprot 数据库将所得到的蛋白靶标转换成基因靶标，得到驻景丸活性成分的靶标.

1.3 糖尿病视网膜病变的靶标预测

设置关键词 “Diabetic retinopathy”，利用Disgene数据库、OMIM数据库以及GeneCards数据库进行检索、合并、去重后得到DR的潜在靶标.将驻景丸活性成分的靶标和DR的潜在靶标导入Venny2.1.0中，比对得到二者的交集靶标，即为驻景丸治疗DR的关键靶标.

1.4 驻景丸活性成分-关键靶标-DR网络的构建

将驻景丸的活性成分和驻景丸治疗DR的关键靶标导入软件Cytoscape，以构建活性成分-关键靶标-DR的网络图，其中构建的网络图中“节点”(node)表示驻景丸中药成分、中药所含活性化合物、DR及作用靶标，“边”(edge)表示中药与活性成分、中药与疾病，疾病与靶标、活性成分与靶标间的关系.

1.5 构建蛋白质互作(PPI)网络

将驻景丸治疗DR的靶标上传至在线STRING 11.0数据库，选择物种为“Homo sapiens”,设置最低要求互动分数为0.700，隐藏游离点，获取相应的蛋白质相互作用关系，所得文件保存为TSV 格式.利用COUNTIF 函数计算相应靶标的Count值，所得文件保存为TXT格式.将TSV和TXT文件导入至 Cytoscape 3.6.1 软件，根据Count值调节节点的大小、颜色，以更直观地呈现出主要作用靶标，以及各靶标之间的相互作用关系.

1.6 GO生物学过程富集分析和KEGG通路富集分析

将驻景丸治疗DR的关键靶标导Metascap数据库，选择物种为 “H.sapiens”进行custom analysis，设定阈值P<0.01，最小重叠度(Min Overlap)为3，最小富集程度(Min Enrichment)为1.5，进行GO生物学过程(GO Biological Processes)富集分析和KEGG通路(KEGG Pathway)富集分析.将排名前20的GO生物学过程富集分析结果导入QuickGO数据库进行层级关系分析.分析平台及数据库见表1.

表1 数据库及分析平台

2 实验结果

2.1 驻景丸活性成分筛选及活性成分靶标预测

经检索共获得菟丝子主要化学成分 147个、车前子176 个、熟地黄76个.设置ADME参数筛选后获得菟丝子主要活性成分11个、车前子9个、熟地黄成分2个.经文献报道获得相关成分11个.汇总后保留成分唯一值共获得活性成分31个，筛去无对应靶标成分6个，最终获得驻景丸活性成分25个，见表2.

表2 驻景丸主要活性成分基本信息

2.2 DR靶标的预测及驻景丸治疗DR的关键靶标的预测

通过Disgenet数据库、 Genecards数据库和OMIM数据库共收集与DR相关靶标2 889个.将其与驻景丸活性成分对应的228个靶标作对比，获得共同靶标133个，即驻景丸治疗DR的关键作用靶标，见图 1.

图1 驻景丸治疗糖尿病视网膜病变关键靶标的筛选

2.3 驻景丸活性成分-关键靶标-DR网络的分析

利用Cytoscape软件构建驻景丸活性成分-关键靶标-DR网络图，见图2.此网络共包括162个节点(1个疾病，3个中药，25个化合物成分，133个关键靶标)、432条边(28条中药和化合物成分相互作用；268条化合物成分和潜在靶标相互作用；133条疾病和潜在靶标相互作用；3条疾病与中药相互作用).其中长方形节点分别代表驻景丸中药成分菟丝子、车前子、熟地黄；“V”字形节点代表DR；椭圆节点代表驻景丸活性成分；菱形节点代表驻景丸治疗DR的关键靶标；线条代表相互作用关系.而图中驻景丸每个活性成分平均可作用于10.72(268/25)个靶标，每个靶标平均连接2.02(268/133)个化合物成分.其中，菟丝子和车前子都含有化合物槲皮素(quercetin)，对应关键靶标94个；车前子和熟地黄都含有谷甾醇(sitosterol)，对应关键靶标10个.车前子中熊果酸(ursolic acid)对应关键靶标45个；菟丝子中山萘酚(kaempferol)对应关键靶标 29个；异鼠李素(isorhamnetin)对应关键靶标12个.DL 值最高的为芝麻素(sesamin DL=0.83)对应关键靶标16个.充分体现驻景丸治疗DR具有多成分、多靶标的特点.

图2 驻景丸活性成分-关键靶标-DR的网络图

2.4 蛋白质互作网络

将获得的133个驻景丸治疗DR的关键靶标上传至STRING 11.0 数据库，获取相应的蛋白相互作用信息.根据COUNTIF函数计算count值，将利用STRING数据库所得的靶标相互作用关系导入 Cytoscape软件，制作关键靶标相互作用网络图，使其可视化，最终筛选获得关键靶标蛋白(圆形节点)127个，节点的面积越大，代表其count值越大；边1146条，代表靶标之间的相互关联，见图 3.并筛选列举驻景丸治疗DR排名前30 的关键靶标，见表3.根据count值分析，可认为丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶(Akt1)、白细胞介素6(IL6)、细胞肿瘤抗原P53(TP53)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、信号转导和转录激活因子3(STAT3)、丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、肿瘤坏死因子(TNF)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、转录因子AP-1(JUN)、表皮生长因子(EGF)这10个靶标与驻景丸治疗糖尿病视网膜病变相关性最大，推测这10个靶标为治疗DR的核心靶标.

表3 驻景丸治疗DR的PPI网络关键靶标(排名前 30)

图3 驻景丸治疗DR的蛋白质互作网络

2.5 驻景丸治疗DR基因GO生物学过程分析及KEGG通路富集分析

将驻景丸治疗DR的关键靶标输入Metascape数据库进行GO生物学过程富集分析和KEGG通路富集分析.GO富集分析(P<0.01)排行前20，见图4，结果表明驻景丸可能通过对无机物的反应、脂多糖的反应、细胞因子介导的信号通路、对有毒物质的反应、凋亡信号通路、对细胞外刺激的反应、细胞对有机氮化合物的反应、对伤害的反应、活性氧物质代谢过程、细胞增殖或迁移等生物学过程发挥药效.通过对排名前20的GO生物学过程进行层级关系分析，见图5，发现其主要与刺激反应(response to stimulus)、信号通路(signaling)、生物免疫调节(biological regulation)、细胞过程(cellular process)、代谢过程(metabolic process)相关.根据KEGG 通路富集分析(P<0.01) 排行前20，见图6，结果表明：驻景丸可能通过调控糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(见图7)、 癌症信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、HIF-1信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂抗性、阿米巴病、丙型肝炎、NF-κB信号通路、肌萎缩性侧索硬化、胰岛素抵抗等通路来治疗DR.

图4 驻景丸治疗DR的关键靶标GO分析(排名前20)

图5 GO生物学过程层级关系图

图6 驻景丸治疗DR的关键靶标KEGG分析(排名前20)

图7 糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路图

3 讨 论

驻景丸是治疗眼科疾病的经典古方，现代临床常采用加减驻景丸治疗青少年近视[11]、眼底黄斑疾病[12]、糖尿病视网膜病变[13]等疾病.方中菟丝子，熟地黄均可滋补肝肾，车前子清肝明目，三者配伍使目得肝血能视，肾精上注目明.本研究通过 TCMSP、SymMap、Disgenet、GeneCards和OMIM数据库分析了驻景丸3味中药(菟丝子、车前子、熟地黄)治疗DR的主要活性成分，其中槲皮素具有心脏保护、抗炎、抗过敏、抗病毒、抗肿瘤、抗高血压等作用[14]，Hatice Iskender[15]等人发现其在降低血糖水平方面也发挥一定作用.Castro AJ[16]等人研究发现熊果酸可增加胰岛素分泌，具有较强的抗高血糖作用.异鼠李素是槲皮素的衍生物，在不同疾病中发挥抗氧化和抗炎作用，Jamali-Raeufy N[17]等人研究发现异鼠李素可降低链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠血糖水平，抑制星形胶质细胞活化和乙酰胆碱酯酶活性，减轻氧化应激反应和炎症反应，对大脑中与糖尿病引起的变化有潜在的神经保护作用.此外，芝麻素在抗高血压、降低胆固醇、降血糖方面也显示出一定的药理活性[18].

葡萄糖、乳糖等还原糖可以与蛋白质的氨基发生非酶促反应，形成不稳定的schiff碱，然后形成Amadori产物.这些早期糖基化产物会进一步发生重排，脱水和缩合等复杂反应，产生 “高级糖化终产物”(AGEs).在衰老或者某些病理条件下，例如糖尿病患者，各种组织中会形成和积累大量的AGEs[19-21].有研究表明RAGE是AGEs的信号转导受体，并且AGEs与RAGE会相互作用会激活NADPH氧化酶、蛋白激酶C和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等多种细胞内信号通路，进一步激活NF-κB活性，促进IL-1、IL-6、TNF-α等促炎细胞因子的表达，引起血管炎症并刺激肿瘤生长[22].在DR的早期阶段，视网膜脱离的表征是微动脉瘤、血管通透性增强、视网膜增厚和硬渗出物的形成等，这些因素会导致黄斑受到影响，从而使视力下降.随着时间的推移，视网膜缺血使Bcl-2和Bax表达非常明显，从而上调VEGF的表达[23].VEGF过量产生，会激活AGE-RAGE信号通路[24-25]，AGEs可影响诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达，在糖尿病并发症中显示出明显的神经毒性和损伤作用[26-27]，进一步破坏血管-视网膜屏障，进而产生新血管，导致玻璃体出血、纤维化、牵拉性视网膜脱离甚至失明[28].

近年来，2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)发病率显著上升，众多并发症都与T2DM有关，包括失明，肾衰竭和心脏功能障碍等.T2DM是以胰岛素抵抗(IR)、高血糖和高血脂症为特征的一种综合性代谢障碍.胰岛素受体(INSR)/磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/ 蛋白激酶B(AKT)信号通路是一条经典的与葡萄糖摄取相关的主要途径[29].正常情况下，胰岛素可抑制Akt的磷酸化，但过多卡能量的摄入会导致游离脂肪酸积累和脂肪细胞增大，巨噬细胞化学吸引剂分泌增加，导致巨噬细胞浸润到增大的脂肪细胞中[30]，并激活有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和PI3K炎症信号通路，进一步激活NADPH，促进caspase-3的激活，导致IL6和TNFα分泌增加[29].TNFα是一种促炎性细胞因子，它在包括肥胖症和胰岛素抵抗在内的各种代谢综合征的发作中起着至关重要的作用.TNFα分泌增加会导致慢性炎症状态，这可能会损伤胰岛素信号通路，加重胰岛素抵抗[31].同时在脂肪细胞促炎条件下，TNF-α的升高水平也会通过激活几种Ser / Thr激酶(如：IKKβ，JNK，PKCθ，p38 MAPK等)来损害胰岛素信号转导级联反应，从而导致血糖升高[32-33].

综上所述，本研究运用网络药理学的方法研究驻景丸治疗DR的机制，将所得到的133个关键靶标通过GO生物学过程富集分析和KEGG富集分析，得到多条与DR密切相关的通路，如：AGE-RAGE信号通路、 癌症信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、HIF-1信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂抗性、NF-κB信号通路、胰岛素抵抗等.结合GO分析，这些通路主要与刺激反应、信号通路、细胞过程、代谢过程、生物免疫调节等生物学过程相关.本研究充分体现驻景丸治疗DR具有多成分、多靶标、多途径协同发挥药效的特点，为后续对驻景丸治疗DR的研究提供参考依据和新思路.该预测结果与现有文献报道结果高度符合，但由于现有数据库并不完整，驻景丸仍有 5个化学式未找到相应靶标.无法确定驻景丸配伍后潜在活性成分含量、种类及药代动力学是否发生变化.所以网络药理学当前仅为理论上的预测，药物的相关机制还需要进一步进行科学验证.