棉花根际土壤真菌分离及黄萎病菌拮抗菌的筛选

郝海婷 牛冬冬 阿依妮萨·阿卜力海提 代先兴唐泽文 李 猛 武 刚

（1塔里木大学植物科学学院/南疆农业有害生物综合治理兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

（2南京农业大学植物保护学院，江苏 南京 210095）

（3新疆生产建设兵团第一师农业科学研究所，新疆 阿拉尔 843300）

棉花是我国重要的一种经济作物。新疆棉花总产量已连续20多年位居全国第一位[1]。随着种植面积的不断扩大和连作种植，土传病害发生严重，尤其是由大丽轮枝菌引起的棉花黄萎病是棉花主产区的重要病害，已严重影响棉花的产量和品质[2-3]。

一直以来，棉花黄萎病的防治比较困难，尚未找到根治的有效防治方法。当前，在新疆地区，棉花黄萎病的防治大多采取“预防为主，综合防治”的植保策略，主要通过种植抗病、耐病品种以及结合轮作、深翻等措施控制棉花黄萎病蔓延[4-5]。近年来，土壤消毒、种子消毒以及生物防治等手段逐渐在棉花黄萎病病害防治中开始应用[5-6]。

生物防治既符合人们对绿色环保的需求，又可为农业可持续发展提供保障，现已成为防治植物病害的研究热点。生物防治方法中，利用有益微生物防治各种植物病害是切实可行的策略之一[7]。对植物病害有拮抗效果的有益微生物包括真菌、细菌和放线菌。拮抗真菌大多存在于植物根系和叶围，对植物有着很好的亲合性，在作物上定植，生防效果稳定，拮抗菌分泌次级代谢产物，通过直接或间接的方式，达到阻碍或杀死病原菌的效果[8-9]。因此，寻找环境中高效、多功能的生防微生物是目前棉花黄萎病防治的发展方向[10]。

本研究通过对田间3株健康棉花的根际土壤真菌进行分离和纯化，利用皿内对峙方法筛选对棉花黄萎病菌有抑制效果的拮抗菌，并利用分子方法鉴定菌种，明确其种属地位，为研制防治棉花黄萎病的高效绿色微生物制剂提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 土壤拮抗真菌的分离、纯化、形态观察

棉花品种为新陆中37。选取棉田3个不同点分别取棉花根际土样，每个点选择一株健康棉花根际土壤。棉花根际土样真菌分离采用稀释平板法。具体步骤为：取棉花根际土样5 g，悬浮于45 ml无菌水中，在水平摇床上以80 rpm、25℃条件下振荡培养20 min，即得悬液，并以此稀释至10-5倍。采用PDA培养基，用移液器分别取土壤稀释液0.1 mL涂布于PDA培养基平板上，25℃培养4～5 d，选取生长良好的菌落继续纯化3次，观察记录。

1.2 棉花根际土壤微生物DNA提取

一种快速提取DNA的方法，具体步骤如下所示。第一步：无菌条件下，用无菌枪头挑纯化好的菌丝到1.5 mL离心管；第二步：加入50 uL 10*TE buffer溶液，振荡分散菌丝；第三步：封口，微波炉700 W 2 min；第四步：取出立即冰浴2 min，然后离心10 min；第五步：移液器缓慢取10 uL上清液作为PCR模板。

1.3 拮抗真菌的分子鉴定

以提取DNA为模板进行rDNA-ITS、EF-1α、βtubulin和ACT基因测序，在NCBI网站进行Blast比对，选取序列同源性比较值较高的作为参考菌株，评估物种的相似度。所用引物序列见表1。

PCR反应体系为25 uL：DNA模板1 uL，2×Es Taq Master Mix12.5 uL，引物-F0.3 uL，引物-R0.3 uL，ddH2O 10.9 uL。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，然后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.4 抑菌实验

通过平板对峙法测定分离真菌对大丽轮枝菌的拮抗效果，具体步骤：在新鲜固体PDA培养皿正中间用记号笔分别在距离点2.5 cm左右两侧同一水平线上做标记；用8 mm无菌打孔器在大丽轮枝菌培养皿边缘打孔，菌饼菌丝面朝下放入PDA左侧标记处，封口，放入28℃培养箱中培养5～7 d（大丽轮枝菌生长缓慢）；生长5～7 d的大丽轮枝菌培养基另一端加入纯化后的分离真菌，同样用8 mm无菌打孔器打孔，菌饼菌丝面朝下放入，28℃培养箱中培养，直至产生抑菌圈；对照是在新鲜固体PDA培养皿左侧标记点打上8 mm大丽轮枝菌菌饼，右侧标记点打8 mm PDA空白菌饼，放入28℃培养箱培养；每个实验三个生物学重复。

表1 所用引物序列及其来源

计算抑菌率：抑菌率=（对照组真菌菌落生长直径-处理组真菌菌落生长直径）/对照组真菌菌落生长直径×100%。抑菌率数值越高说明抑菌作用越强，拮抗效果越好。

1.5 数据处理

使用Excel对数据进行处理；使用Bioedit进行序列整理，进一步在NCBI上比对。

2 结果与分析

2.1 棉花根际土壤真菌的分离情况

采用稀释平板法进行菌株的分离与纯化，从3份土壤样本中分离获得若干菌株，针对这些分离真菌的菌落形态特征进行初步判断，将这些菌株分为3大类。第一类菌株包括C11，菌株C11接种至PDA培养基中，培养5 d后，菌落正面呈白色，背面呈淡黄色，边缘菌丝形状不规则（图1：A和B）；第二类菌株包括C41、A21和C421，菌落呈波浪状或高山状，气生菌丝呈白色，且辐射状蔓延，有的菌株有白色菌丝隆起，7 d后菌丝几乎铺满整个培养皿，基内菌丝多层重叠（图 1：C和 D）；第三类菌株包括 B11、B51、C31和C91，菌落正面呈白色，5 d左右后背面呈淡粉色，菌丝发达，绒毛状（图1：E和F）。

图1 代表菌株菌落形态图

2.2 棉花黄萎病拮抗菌的筛选

采用皿内对峙法对分离真菌进行抑菌试验（见表2、图2）。结果显示，与对照相比，分离出的每株真菌都对棉花黄萎病菌有一定的抑制作用，抑菌率为29.51%～42.86%，说明这些菌可能产生了具有抑制棉花黄萎病菌活性的代谢产物。

表2 棉花根际土壤分离真菌对棉花黄萎病菌的抑制效果

图2 棉花根际土壤分离真菌对棉花黄萎病菌菌丝生长的抑制作用

2.3 棉花根际土壤真菌的分子生物学鉴定结果

采用通用引物ITS1和ITS4，扩增8株菌株，得到的片段长度为570～680 bp之间（见表3）；分别采用EF-1α、β-tubulin和ACT基因扩增根际土壤真菌，扩增片段范围分别为 216～229 bp、329～439 bp和 268～274 bp。

将测序结果进一步和NCBI上的基因序列进行比对（表3），结果表明：分离获得的B11菌，其ITS序列与粉红粘帚霉Clonostachys rosea菌株的ITS序列同源性为99.83%（登录号KX058045.1）、EF-1α序列与C.rosea菌株同源性为97.99%（登录号MK752496.1）、β-tubulin序列与C.rosea菌株同源性为98.07%（登录号KJ413352.1）、Actin序列与C.rosea菌株同源性为98.85%（登录号MH102067.1）。分离获得的B51菌，其ITS序列与粉红粘帚霉C.rosea菌株的ITS序列同源性为99.82%（登录号MT845995.1）、EF-1α序列与C.rosea菌株同源性为98.01%（登录号MK752496.1）、β-tubulin序列与C.rosea菌株同源性为98.37%（登录号AF358166.1）。分离获得的C31菌，其ITS序列与粉红粘帚霉C.rosea菌株的ITS序列同源性为99.83%（登录号 KX058045.1）、EF-1α序列与C.rosea菌株同源性为97.99%（登录号MK752496.1）、β-tubulin序列与C.rosea菌株同源性为96.90%（登录号KJ413352.1）、Actin序列与C.rosea菌株同源性为99.23%（登录号MH102067.1）。分离获得的C91菌，其ITS序列与粉红粘帚霉C.rosea菌株的ITS序列同源性为 99.83%（登录号KX058045.1）、EF-1α序列与C.rosea菌株同源性为99.49%（登录号MT462122.1）、β-tubulin序列与C.rosea菌株同源性为97.83%（登录号KJ413352.1）。

分离获得的C11菌，其ITS序列与球毛壳菌Chaetomium globosum菌株的ITS序列同源性为100.00%（登录号MN809366.1）；C41、A21和C421菌株，其ITS序列与高山被孢霉Mortierella alpina菌株的ITS序列同源性分别为99.41%（登录号MF093212.1）、99.71%（登录号KX343169.1）和99.56%（登录号MT453270.1）。

根据分子研究结果，结合形态学的初步鉴定，该8株菌中B11、B51、C31和C91为C.rosea，归属于真菌界，半知菌门，丛梗孢科，粘帚霉属；C41、A21和C421为M.alpina，归属于真菌界，接合菌门，被孢霉科，被孢霉属；C11菌株为C.globosum，归属于真菌界，子囊菌门，毛壳科，毛壳属。

表3 棉花根际土壤真菌的rDNA-ITS、EF-1α、β-tubulin和ACT序列相似性分析

3 讨论与结论

粉红粘帚霉是重要的生防真菌，具有生长速度快、产孢量大、拮抗能力强等多种优点，除了对病原菌有重寄生、抗生、溶菌、竞争作用外，还能诱导植物产生系统抗性[11]，有良好的开发和应用价值。高航等[12]研究发现粉红粘帚霉有较强的寄生能力，对林果枝干病害病原菌抑制率达60%以上；赵士振等[13]研究发现粉红粘帚霉对果蔬灰霉病有很好的防效，能有效的寄生灰霉菌核及抑制孢子的产生；杨蕊等[14]研究发现粉红粘帚霉菌丝可以重寄生苗期玉米茎基腐病病原菌菌丝,导致病菌菌丝细胞原生质颗粒化、溃解，从而达到防治效果。但目前有关粉红粘帚霉防治棉花黄萎病的报道较少，有待进一步围绕粉红粘帚霉防治棉花黄萎病开展系统研究。

本研究还分离出一株在农业和工业都有应用的球毛壳菌。该菌对病原微生物和蚜虫的生物防治有显著作用[15-17]，可产生大量有生物活性的次级代谢物[18]，如球毛壳菌素，具有广谱拮抗性和抗逆性，对多种作物病害具有良好的防治效果。现有研究结果表明，球毛壳菌作为拮抗菌对三七根腐病[19]、油菜根肿病[20]、玉米大斑病[21]以及南方根结线虫[22]都有很好的防治效果。新疆棉花的产量和品质主要受棉花黄萎病和棉蚜的影响，后续有必要将球毛壳菌作为潜在的棉花黄萎病和棉蚜防治菌，采用以菌治菌、以菌治虫的防治策略，开发利用球毛壳菌防治棉花病虫害。

综上所述，本研究通过对棉花根际土壤真菌的研究，获得的2株潜在拮抗菌（粉红粘帚霉和球毛壳菌），可为进一步有效防治棉花黄萎病提供菌种资源[23]，对后续棉花黄萎病在生物防治方面的研究具有重要意义。