异丙酚通过调节CIP2A/PP2A 通路抑制HepG2 细胞增殖

庞 荣，周 全， 李 茂

（1.江苏徐州医科大学附属淮安医院麻醉手术中心，淮安 223002； 2.江苏淮安市第二人民医院骨科，淮安 223002；3.江苏淮安市妇幼保健院麻醉科，淮安 223002）

肝癌是常见恶性肿瘤之一，其特点是侵袭性强，且发病率逐年增高[1]。慢性肝炎、肝硬化及过量饮酒是肝癌发生的主要危险因素[2]。目前肝癌的治疗手段主要包括手术切除及肝脏移植[3]。然而，研究[4]表明，手术过程中的操作及应激等会促进肿瘤细胞的生长及侵袭。因此，手术中选用能够抑制肿瘤细胞生长的麻醉药物或方法对肿瘤预后有重要意义。

异丙酚是常用静脉麻醉药物之一，有高脂溶性并可以自由通过血脑屏障[5]，因此起效快、不良反应少，临床上主要用于诱导、维持麻醉和镇静等，同时异丙酚还是一种止吐药。研究[6]表明，异丙酚除麻醉效应外，还有许多其他有益效应，包括免疫调节、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等。近年来，发现异丙酚能够显著抑制人肝癌HepG2 细胞株的生长和侵袭能力[3]。Sun 等[7]研究发现异丙酚可以通过升高lncRNA 的DiGeorge 综合征临界区基因5（digeorge syndrome critical region gene 5，DGCR5），并抑制Raf1/ERK1/2 和Wnt/β-catenin通路来抑制肝癌细胞的生长和转移。Zheng 等[8]也发现异丙酚可以通过下调Twist1 的表达来抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）作为一种人们熟知的肿瘤抑制因子，在真核细胞内含量十分丰富，是一种可以调控多种癌症信号通路的因子，其活性的改变与肿瘤发生密切相关，已经成为许多肿瘤潜在的治疗靶点[9]。蛋白磷酸酶2A 的癌性抑制因子（cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A，CIP2A）是PP2A 的内源性抑制剂，通常与癌基因c-Myc 相互作用，通过抑制PP2A，从而稳定c-Myc 蛋白的表达，进而促进肿瘤的发生发展[10]。本课题组前期研究证实异丙酚可以调节CIP2A 的表达，但是异丙酚是否可以通过CIP2A/PP2A 抑制肝癌细胞的发生、发展，却鲜见报道，因此本文针对这一问题进行相关研究。

1 资料与方法

1.1 材料与试剂

胎牛血清（FBS）、高糖培养基（DMEM）均购自美国Life Technologies；异丙酚、二硫苏糖醇（DTT）、十二烷基硫酸钠（SDS）、四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵（AP）、二甲基亚砜（DMSO）均购自Sigma-Aldrich；MTT 购自Solarbio；RIPA裂解液购自Applygen；丙烯酰胺购自Solarbio；CIP2A、PP2A、c-Myc 抗体及辣根过氧化物酶标记的二抗均购自Abcam；ECL 发光检测试剂盒购自诺唯赞生物科技有限公司；BCA 试剂盒购自Cayman 公司；Trizol 购自Transgene Biotech 公司；EvaGreen qPCR MasterMix 购自ABM（Canada）公司；Lipofectamine 2000 购自Invitrogen Life Technologies 公司；HepG2来自Procell Life Sicence ＆Technology 有限公司；CIP2A 过表达腺病毒（Ad-CIP2A）、CIP2A 干扰腺病毒（Si-CIP2A）和仅表达GFP 的腺病毒（NC组）购自上海吉玛制药有限公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT 实验测定异丙酚对HepG2 细胞增殖的影响 将HepG2 细胞以每孔2×104/mL 的细胞密度接种于96 孔细胞培养板中，每孔体积200 μL。细胞分成NC 组（空载腺病毒组）、Ad-CIP2A组（CIP2A 过表达组）及Si-CIP2A 组（CIP2A 敲低组），每组分别给予不同浓度的异丙酚（10、20 和30μM）培养24 h 后加入MTT 溶液继续孵育4 h 后每孔加入200 μL 的DMSO，选择490 nm 波长测定吸光度A，酶联免疫检测仪上检测各孔的A 值，以只加培养液、MTT 和DMSO 的3 孔作为调零孔。绘制生长曲线。细胞存活率=给药组吸光度/NC组吸光度的平均值。

1.2.2 实时定量PCR 检测HepG2 细胞CIP2A、PP2C 和c-Myc 的mRNA 表达 所有引物均为梓熙生物科技有限公司合成。不同浓度异丙酚孵育人HepG2 细胞24 h 后用Trizol 试剂提取总RNA，用TranScript 合成cDNA，用EvaGreen qPCR MasterMix 测定mRNA 表达水平。实时定量PCR循环参数设置如下：95 ℃，10 min；95 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s；共40 个循环。本研究主要用到的引物包括：CIP2A-F 为TACGAATTCATGCGACGG-CTGCTGATC，CIP2A-R 为TACCTCGAGGGAGAAGGCGAACTGTCCAG；β-actin-F 为ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG，β-actin-R为AGGAAGGAAGGCT-GGAAGAGTG；PP2A-F为CGGTGCTCATAGACGAACTC ，PP2A -R 为TCACTTCGGGTCCTTTCAAC。qRT-PCR 结果计算方法：目的基因的表达水平=2^-（目的基因Ct值-内参基因Ct 值）。

1.2.3 siRNA 转染HepG2 细胞 使用Lipofectamine 2000 将CIP2A siRNA 或对照siRNA 转染进HepG2 细胞，转染后48 h 镜下观察到明显荧光表达，说明转染成功。转染成功后提取RNA 或者蛋白检测CIP2A 敲低效率。靶向CIP2A 的siRNA 由上海吉玛制药有限公司设计合成，siRNA 序列如下：CIP2A siRNA 为5'-GGUGCACGUUUCAUCAAUU-3'；NC siRNA 为5'-CGGAUCGUCAAUGGCAGCU-3'。

1.2.4 Western blot 检 测HepG2 细 胞CIP2A、PP2A 和c-Myc 蛋白表达 用不同浓度异丙酚孵育HepG2 细胞24 h 后提取总蛋白，BCA 试剂盒测定总蛋白质浓度，将各组蛋白质浓度调到同一水平，置于-70 ℃冻存（低温冰箱）。制备10%SDS；聚丙烯酰胺凝胶，样品加热变性后，每孔加蛋白样品20 μg 电泳，半干式电转移仪转膜到PVDF 膜；5%脱脂奶粉室温封闭1 h，单克隆一抗（1∶2000 稀释），4 ℃过夜，洗膜，按1∶5000 加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2 h，洗膜后加入增强型化学发光试剂，显色。用Image J 对蛋白条带进行定量，采用Graphpad Prism 5.0 进行统计分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 11.5 软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t 检验或方差分析。P≤0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度异丙酚对HepG2 细胞的增殖的影响

不同浓度的异丙酚孵育三组HepG2 细胞24 h，MTT 法测定其对HepG2 细胞增殖的影响。随异丙酚浓度增加，NC 组、Ad-CIP2A 组及Si-CIP2A组的HepG2 细胞的存活率均逐渐降低（P均＜0.05）。而Si-CIP2A 组相较于NC 组，HepG2 细胞的整体存活率显著下降（P均＜0.05）；Ad-CIP2A 组与NC 组相比存活率差异无统计学意义（图1）。

2.2 异丙酚调节HepG2 细胞CIP2A/PP2A 通路相关基因的表达

异丙酚浓度≥20 μM 时，HepG2 细胞CIP2A mRNA 表达量均低于NC 组（P均＜0.05）；异丙酚浓度≥10 μM 时，PP2A mRNA 的表达量均高于NC 组（P均＜0.05），c-Myc mRNA 的表达量均低于NC 组（P均＜0.05）（图2A）。siRNA 将CIP2A 敲低以后，异丙酚各浓度对CIP2A mRNA 表达水平无影响，各浓度差异均无统计学意义（P均＞0.05）；而PP2A mRNA 的表达水平均升高（P均＜0.05），c-Myc mRNA 表达量均下降（P均＜0.05）（图2B）。CIP2A 过表达后，CIP2A、c-Myc 和PP2A 的mRNA 在各异丙酚浓度组间差异均无统计学意义（P均＞0.05）（图2C）。

2.3 异丙酚调节HepG2 细胞CIP2A/PP2A 通路相关蛋白的表达

异丙酚浓度≥20 μM 时，HepG2 细胞中CIP2A蛋白表达均降低（P均＜0.05）；异丙酚浓度≥10 μM时，c-Myc 的蛋白表达水平均降低（P均＜0.05），而PP2A 蛋白表达水平均增加（P均＜0.05）（图3A）。在CIP2A 敲低后，异丙酚各浓度对CIP2A 蛋白表达水平均无影响（P均＞0.05）；当异丙酚浓度≥10 μM 时，PP2A 蛋白水平均升高（P均＜0.05），c-Myc 的蛋白表达量均下降（P均＜0.05）（图3B、图4）。CIP2A 过表达后，CIP2A、c-Myc 和PP2A的蛋白在各异丙酚浓度组间差异均无统计学意义（P均＞0.05），见图3C、图4。

3 讨论

原发性肝癌是最常见的消化系统肿瘤之一，近年来发病率和病死率明显升高[11]。早期原发性肝癌缺乏有效的生物标志物，手术切除成为治疗肝癌的最有效选择，手术治疗也较其他治疗方式存活率高[12]。另外，合理的选择麻醉药物对于肝癌术后发展及其治疗也有着至关重要的作用[13]。本课题组研究的异丙酚，也是常用的静脉麻醉药物之一。

研究[14]表明，许多麻醉药物（如异丙酚、丙泊酚）对肝癌的术后存活率有显著影响。关于异丙酚对肝癌的抑制作用研究也越来越多，其可以抑制肝癌细胞的增殖、转移等[15-16]。也有文献[17]报道，异丙酚可以通过调节PP2A 的表达而对高血糖进行调节。异丙酚还可以通过下调PP2A 的表达，从而抑制内皮黏附分子的表达及单核内皮细胞的相互作用[18]。有许多研究已经证明异丙酚可以通过多种途径抑制肝癌的发生发展，如通过调节DGCR5 抑制肝癌[7，19]。CIP2A/PP2A 具有诱导肝癌细胞自噬、凋亡、抑制生长等作用。Lu[20]等研究发现在肝癌细胞中，CD24 过表达会导致PP2A蛋白表达量增加，并诱导mTOR/AKT 通路失活，从而增强自噬水平，调节耐药性。Shu[21]等研究发现异莲心碱可以减少PP2A/I2PP2A 相互作用并刺激丝氨酸536 位点上PP2A 依赖的p65 的去磷酸化来抑制肝细胞癌。Yu[22]等发现新型埃罗替尼衍生物TD52 可以通过抑制CIP2A，增强PP2A 活性来诱导肝癌细胞凋亡。

本课题组通过MTT 实验，发现异丙酚可以抑制HepG2 细胞的增殖。另外，实时定量PCR 结果显示，异丙酚能够剂量依赖性地升高抑癌因子PP2A 的mRNA 水平，降低CIP2A 和c-Myc 的mRNA 水平来抑制肝癌细胞的增殖，这是因为CIP2A是PP2A 的一种内源性抑制剂，当CIP2AmRNA表达降低的时候，PP2AmRNA 由于缺乏抑制剂会出现明显的上升。当敲低CIP2A 的表达后，PP2Am-RNA 表达升高，且CIP2A 和c-Myc 的mRNA 表达降低。同时我们还在蛋白水平验证了异丙酚对CIP2A/PP2A 通路的影响。同mRNA 表达水平一致，随着异丙酚浓度升高，PP2A 蛋白表达水平逐渐升高，CIP2A 和c-Myc 蛋白表达逐渐降低，且在CIP2A 敲低后，CIP2A 蛋白水平整体降低的更明显，HepG2 细胞存活率更低。腺病毒转染HepG2细胞，过表达CIP2A，再去检测上述分子的mRNA和蛋白表达，发现在过表达CIP2A 后，随着异丙酚浓度的增加，CIP2A 和c-Myc 的表达并无显著性降低，说明过表达CIP2A 后，异丙酚抑制肝癌细胞的作用消失了，说明异丙酚是通过CIP2A 抑制肝癌细胞增殖的。过表达或敲低CIP2A 都证明了异丙酚可以通过调控CIP2A/PP2A 通路相关分子的表达抑制肝癌细胞增殖。影响CIP2A/PP2A 通路是异丙酚抑制肝癌细胞增殖的机制之一，但可能不是惟一的机制，其他机制还有待后续研究。

综上所述，异丙酚可以抑制肝癌细胞的增殖，且机制与CIP2A/PP2A 有关，这一发现为未来肝癌手术治疗的药物选择提供了依据，也为肝癌治疗提供了新的治疗靶点。