多发性骨髓瘤的精准医疗:耐药机制与相关生物学标志物的探索

胡 柯 陶 怡 施菊妹

肿瘤异质性是指恶性肿瘤及其细胞因个体差异或在个体分布部位的不同，致使其表达的基因型或生物表型存在差异，导致其对不同化学治疗(简称化疗)药物的敏感性出现差异。近年来，学者逐渐意识到肿瘤异质性对多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)疾病进展和耐药具有影响；特别是细胞遗传学定义的高风险患者，其基因组异质性可存在明显的动态变化。这些动态变化表现为在肿瘤发生、发展过程中和不同治疗选择的作用下，不同亚克隆来源的肿瘤细胞的生长优势发生改变，即所谓动态异质性。具有新生长优势的肿瘤细胞克隆亚群极有可能对原有治疗方案产生耐药，而动态异质性与治疗方案、治疗时间、个体高危因素均相关，但其相关程度和形成机制，仍需更大规模的随机对照研究以进一步探索、明确。如果说动态异质性是治愈复发或难治多发性骨髓瘤(relapsed/refractory multiple myeloma, RRMM)的难点和关键点，那么寻找可靠的耐药相关生物学标志物，开发对应的识别分析技术，则成为未来攻克RRMM的重点。以此为基础的精准医学可以足够灵活的模式，应对复杂多变的MM动态异质性，在整个疾病过程中及时调整治疗方案，延长患者生存时间。

1 普遍耐药机制与相关生物学标志物

1.1 骨髓微环境 骨髓微环境包含细胞成分、细胞外基质，以及可溶性成分，这些成分形成一个复杂的网络，在MM的发生、发展中起重要作用。微环境介导的耐药性(environment mediated-drug resistance, EM-DR)是MM细胞的旁分泌效应与微环境相互作用的结果。MM细胞促进可溶性因子(如IL-6)的分泌和摄取。IL-6可通过直接激活Janus激酶/信号转导与转录激活子(the Janus kinase/signal transducer and activator of transcription, JAK/STAT)、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)等级联信号通路，或由血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)间接促进血管生成，影响MM细胞的存活，并介导MM的耐药[1]。这些促进旁分泌信号异常转导的可溶性因子存在不同的表达模式，而其下游分子或可成为EM-DR相关的生物学标志物。例如，可通过靶向胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor-1 receptor, IGF1R)或阻断其下游的丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine kinase, AKT)信号通路来对抗由胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1 , IGF1)/IGF1R轴上调介导的MM耐药。目前，已有AKT抑制剂投入临床前研究或临床Ⅰ或Ⅱ期试验，其安全性和有效性也已得到初步验证[2-3]。

几乎所有类型的细胞都释放外泌体，其通过转移信使核糖核酸(mRNA)、微核糖核酸(microRNA)和蛋白质来介导局部细胞间的通信。MM细胞与骨髓间充质细胞间的双向交流即可通过外泌体进行。研究[4]发现，在硼替佐米、美法仑的作用下，可见细胞外泌体的分泌显著增多。同时，由于细胞外游离microRNA可受到外泌体的保护，从而具有极高的稳定性，且拥有较高的血清丰度，这意味着异常的microRNA表达谱可为MM分级、预后及其耐药分析提供依据。Jung等[5]对MM患者的循环microRNA表达进行量化发现，某些microRNA的表达水平，尤其是microRNA-29c-3p水平，与来那度胺联合低剂量地塞米松治疗RRMM的疗效呈负相关；Manier等[6]则发现，检测循环microRNA let-7b和microRNA-18a的表达水平对判断MM预后具有重要意义。

此外，在药物作用后，外泌体还会出现蛋白质表达谱的改变，如其表达的乙酰肝素酶就有药物剂量相关性的上调。乙酰肝素酶可以通过降解细胞外基质促进肿瘤细胞的转移。而当外泌体暴露于肿瘤细胞或巨噬细胞时，可将其自身携带的肝素酶转移至这些细胞，通过激活信号通路 [如细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)、AKT]促进耐药，最终导致疾病复发。

1.2 外排转运蛋白质活性异常 MM的多重耐药与转运蛋白质异常表达亦有关，其中三磷酸腺苷结合盒转运蛋白质(ATP binding cassette transporter, ABC)超家族的作用受到研究者的重视。其G亚家族成员ABCG2与MM的耐药相关；有研究[7]发现，接受托泊替康治疗后复发的患者ABCG2 mRNA表达水平增高，这可能与该基因启动子的甲基化相关；而其B亚家族成员ABCB1过度表达则是MM细胞对第二代蛋白酶体抑制剂——卡非佐米耐药的最显著的特征。此外，目前用于治疗MM的许多药物(如阿霉素、依托泊苷)是已知的C亚家族成员ABCC2底物，ABCC2可将这些药物排出肿瘤细胞外，导致耐药[8]。研究[9]还指出，通过检测多能性干细胞染料(如CDy1)的着色强度可测定ABCB1转运体的流出活性，这可能是一种预测MM患者对卡非佐米反应的有效方法。当检出MM患者存在外排转运蛋白质的异常，其治疗方案则将改为使用外排抑制剂。目前，已有在MM中表现出良好临床前疗效的外排抑制剂，如奈非那韦和洛匹那韦。

1.3 药物代谢(简称药代)动力学变异 药物抵抗往往被认为与药效学或者靶细胞有关，而药代动力学异常则是一种未被充分重视的耐药机制。众所周知，药代和系统清除是有效的系统防御，一旦外源性化合物经机体摄入，与药物传感相关的核受体超家族成员结合，这些受体就会转移到细胞核并调控编码Ⅰ相和Ⅱ相药代酶的基因表达，影响其代谢过程[10]。而药代动力学异质性可以通过调节化疗药物的代谢过程使之无法维持有效浓度，从而影响疗效。近期，药物基因组学研究取得巨大进展，即通过研究基因多态性对药代的影响，从而预测患者对药物的敏感性和可能发生的不良反应[11-12]。研究也揭示了若干有意义的药物基因组学变异：在预后良好的MM患者细胞中，编码外源性化合物受体[维甲酸受体(RXRα)、肝脏X受体(LXR)、组成型雄甾烷受体(CAR)、法尼醇受体(FXR)等]的基因表达增加，并相应地表达药代酶和转运蛋白质，而预后不良的患者则恰恰相反[11]。由此，靶向上述受体的激动剂或可为逆转MM耐药开辟新的道路。

2 蛋白酶体抑制剂(PI)的耐药机制与相关生物学标志物

2.1 蛋白酶体β5亚基(PSMB5)基因突变 目前所批准使用的PI都靶向PSMB5基因[10]。以硼替佐米为例，其可逆性地抑制PSMB5基因的糜蛋白酶样活性，导致泛素化蛋白无法降解而积聚，进而诱导细胞凋亡。Barrio等[13]首次发现，相比于初诊原发MM患者，复发患者的PSMB5基因突变频率更高，并且这些突变的PSMB5基因使得硼替佐米耐药患者对其他PI也表现出交叉耐药。研究结果表明，敲除PSMB5基因能提高MM耐药细胞对硼替佐米的敏感性，而PSMB5基因中G332A、A20T位点突变皆位于药物结合域周围，故影响药物结合可能是PSMB5基因突变导致耐药的根本原因。

2.2 热休克蛋白(heat shock protein, HSP)表达上调 HSP作为负责蛋白质折叠的分子伴侣，在蛋白质稳态途径中发挥关键作用。已有多个研究发现，HSP在PI耐药细胞中高表达[包括葡萄糖调节蛋白78(GRP 78)[14]、HSP90、HSP27、HSP70[15]]，而探索并开发HSP抑制剂，以促进MM细胞凋亡是目前研究的热点。除了分子伴侣作用，HSP还涉及多条信号通路，包括JAK/STAT与PI3K等，参与肿瘤的发生、发展。由此，HSP可作为重要的治疗靶点，HSP抑制剂则成为治疗MM的新希望。目前，已有多种HSP90靶向抑制剂进入临床试验阶段，如坦螺旋霉素(tanespimycin)、KW-2478等，他们与硼替佐米的协同作用令人瞩目[16]。

2.3 去分化 在转录水平，B细胞向浆细胞分化受到阶段特异性转录因子的调控，其中转录因子X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1, Xbp1)可通过沉默B细胞的基因来调控浆细胞分化，这是激活抗体分泌细胞的必要步骤。由于MM具有蛋白质过载和内质网应激水平增强的特性，Xbp1常在未经处理的MM细胞中大量表达，然而在RRMM中表达较少。研究[17]发现，敲减Xbp1后，MM细胞在硼替佐米作用下仍可存活。PI通过抑制内质网相关降解途径加重内质网压力致使细胞凋亡，而Xbp1的缺失导致浆细胞成熟障碍，免疫球蛋白分泌不足，减轻了内质网负荷，从而赋予MM细胞PI抗性。阻断Xbp1剪接可增强MM细胞对于PI和HSP90抑制剂的敏感性。体内外研究[18-19]已证实，Xbp1抑制剂具有抗MM作用的临床应用前景。

3 烷化剂的耐药机制与相关生物学标志物

烷化剂是一种周期性非特异性细胞毒性药物。目前被批准用于治疗MM的烷化剂包括美法仑和环磷酰胺，都是DNA链间交联诱导剂。当DNA链间发生错误的共价交联，DNA复制会被阻断，从而达到杀伤细胞的效果。在近期研究中，高分辨率质谱法被应用于准确评价药物诱导的链间交联程度，并且其具有可检测尿液等无创样品的优势，被认为是未来精准医学中一种强有力的工具[20]。

根据烷化剂的作用途径，其在MM中的特异性耐药机制主要体现在DNA损伤与修复通路的调节上，包括参与范科尼贫血(Fanconi anemia, FA)的蛋白质、核苷酸的切除修复、错配修复、同源重组等[21]。范科尼蛋白质与DNA损伤应急蛋白质[共济失调性毛细血管扩张和Rad3-相关性激酶(ATR)、 乳腺癌基因1号(BRCA1)、重组蛋白 A51(RAD51)等]有关，参与DNA修复。研究[22]发现，抗美法仑的MM细胞通过上调FA/BRCA通路的基因表达，去除链间交联，而PARP(poly ADP-ribose polymerase)抑制剂则能通过抑制FA/BRCA通路逆转MM细胞对美法仑耐药。另一方面，碱基切除修复(base excision repair, BER)参与抵抗DNA交联的作用也得到重视。在美法仑耐药的MM细胞中，可见3种BER糖基化酶[Nei样DNA糖基化酶1(NEIL1)、尿嘧啶DNA糖基化酶2(UNG2)、N-甲基嘌呤DNA糖基化酶(MPG)]表达下调[23]。

4 糖皮质激素的耐药机制与相关生物学标志物

大多数糖皮质激素的作用是由糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)介导的，其属于核转录因子，参与多条信号通路，影响靶细胞中基因表达[24]。研究[25]发现，糖皮质激素耐药细胞系表达的GR亚型均低于糖皮质激素敏感细胞，这或许与GR编码基因NR3C1的第2内含子转录延伸阻滞有关。然而Kfir-Erenfeld等[26]却指出，只有少数受糖皮质激素影响的基因与细胞凋亡相关，而仅有这些基因产物的表达并不足以诱导细胞凋亡。由此，糖皮质激素的非基因组效应引起了学者的重视。研究[27]发现，GR可转运至线粒体，降低膜电位并释放细胞色素C和第2种线粒体来源的激活剂(smac/diablo)，从而激活内在线粒体凋亡途径。同时，糖原合酶激酶3(GSK3)和促凋亡的Bcl-2蛋白质(BIM)在GR启动的内在凋亡途径中也起着至关重要的作用。上述作用途径的每一个分子异常都可能导致糖皮质激素耐药，同时也是潜在的干预对象，以增加肿瘤细胞对糖皮质激素的敏感性。如GSK3在糖皮质激素敏感细胞中的活性显著高于耐药细胞，而应用PI3K/AKT的特异性抑制剂——麦草胺，有助于保持GSK3的活性，提高细胞对糖皮质激素敏感性。而如何选择并使用这些潜在的生物学标志物来预测GR反应性仍是目前研究的难点。

5 免疫调节剂(IMiDs)的耐药机制与相关生物学 标志物

近年的研究[28]发现，在第2代IMiDs——来那度胺的作用下，多种MM细胞系中CRBN(cereblon)蛋白质的表达下调，提示CRBN是来那度胺抗MM作用的靶点。此外，复发患者中CRBN的基因突变率远高于初诊患者，并且与IMiDs作用时间呈正相关，而这些突变位点均在IMiDs结合域内。在随后的体外研究中发现，CRBN高表达的MM细胞可重获来那度胺敏感性，而引入CRBN突变基因的细胞则对其耐药，从而证实了CRBN的基因突变能导致来那度胺耐药[29]。目前，新一代CRBN E3连接酶调节剂Ⅰ (berdomide)已进入Ⅰ或Ⅱ期临床试验，其联合地塞米松治疗RRMM的效果显著[30]。

而在分析技术方面，近期针对CRBN在内的常见突变基因的研究应用了具有针对性的二代测序技术，生成了一个包括47个基因的MM突变面板，仅需少量DNA，就能在短时间内准确检测MM患者的基因组，以指导个体化治疗[31]。另外，非质谱法的蛋白质定量技术也被用于MM的研究中，例如，毛细管纳米免疫分析，可以自动定量样品中低浓度的蛋白质。一项研究[32]运用此方法评估了MM相关的12种蛋白质对患者生存的影响，结果显示，CRBN蛋白质水平能预测IMiDs治疗后患者的生存状况，而mRNA水平则与预后无关。这些潜在生物学标志物的探索，以及新兴的肿瘤分析技术都为将来精准治疗MM奠定了基础。

6 总结与展望

目前，大量化合物、免疫疗法在临床前研究中涌现，极大拓展了治疗MM的思路。但我们仍需认识到MM的异质性是动态的，这给肿瘤细胞提供了逃脱多种化疗药物的机会。而将精准医学的理念融入临床中，通过新兴的肿瘤分析技术检测MM患者相关生物学标志物水平，以评估个体对各治疗方案的反应性。这为从新角度认识MM，为个体制订具有针对性、以数据为基础的治疗策略创造了技术条件，或许可以从根本上改变目前MM的治疗模式。而上述的一些定量技术仍待进一步发展，一方面可与具有潜在临床价值的生物学标志物相结合，另一方面不断优化以提高其可行性和经济性；从而早日实现精准医疗在MM临床诊治中的普及。