林蛙油化学成分及其鉴别方法研究进展*

姜希红，张 爽，刘树民

（黑龙江中医药大学 中医药研究院，黑龙江 哈尔滨150040）

林蛙油（Oviductus ranae, OR）是成熟雌性林蛙的干燥输卵管，又称哈蟆油、哈士蟆油、雪蛤油。对于林蛙油的基原问题一直存在争议，目前的研究认为其基原动物应为东北林蛙，中国林蛙为其同物异名[1]。林蛙油性味甘、咸、平，是我国著名的传统动物药，从明清时期就用于治疗或预防各种疾病，包括病后体弱、神疲乏力、心悸失眠、盗汗、痨嗽咳血，更年期综合征等。近年来, 随着林蛙油市场需求量的逐渐增大，林蛙油价格也上涨很多，一些投机者开始销售伪品林蛙油，主要的伪品有青蛙油、牛蛙油、蟾蜍油，因此，研究准确有效的林蛙油真伪鉴别方法十分必要。林蛙油的传统鉴别方法有基源鉴别、性状鉴别、显微鉴别等，现代鉴别方法包括仪器鉴别法、分子生物学方法，本文对林蛙油中的主要化学成分及其鉴别方法总结概括, 以期为准确、快速鉴别真伪林蛙油的研究提供帮助。

1 林蛙油化学成分

1.1 蛋白质和氨基酸

蛋白质和氨基酸是林蛙油中的主要活性成分，林蛙油中富含蛋白质，其蛋白质含量可高达50%以上。对于林蛙油蛋白成分的研究，最早是由日本学者久保田晴光开展。刘春娟[2]等根据蛋白质溶解性的不同，从林蛙油粉末中分离出水溶蛋白、盐溶蛋白、醇溶蛋白和碱溶蛋白4 种可溶性组分蛋白，并进行了相关的抗氧化活性试验。

目前，已鉴定的林蛙油中氨基酸的种类有18种，分别为天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、精氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、色氨酸。其中人体必需、半必需氨基酸10 种。杜景新等[3]将林蛙皮、骨、肝、卵、活性油等部位氨基酸含量进行分析比较，发现背皮中氨基酸含量最低，但仍比30 年野山参含必需氨基酸的量高4 倍多，可见林蛙全身都具有开发价值。

1.2 多糖

多糖也是林蛙油中具有生物活性的主要成分之一。郑卫星等[4]通过SPSS 软件设计正交试验，确定中性蛋白酶水解法提取林蛙油多糖的最佳工艺参数，最终多糖得率为10.4%。杨靖等[5]对比了胃蛋白酶、中性蛋白酶及胰蛋白酶3 种酶对林蛙油多糖得率的影响，结果表明，胰蛋白酶酶解得到的蛋白得率较其他两者高，并且酶解的更彻底，在此基础上确定了多糖的最佳提取工艺，并且发现林蛙油多糖具有显著的抗疲劳活性。

1.3 不饱和脂肪酸

林蛙油中脂肪酸的研究逐渐增多，尤其是对不饱和脂肪酸的研究，不饱和脂肪酸是合成前列腺素所必须的前体，对心脑血管具有保护作用。范玉林[6]等对林蛙油不饱和脂肪酸进行分析研究，得到10-十一碳烯酸、9-十六碳烯酸、11-十八碳烯酸、5, 8,11, 14-二十碳四烯酸、7-九碳烯酸5 种不饱和脂肪酸；杨淑琴[7]等对哈蟆油脂肪酸进行测定，其中的不饱和脂肪酸十六碳烯酸、十六碳二烯酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳二烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸（DPA）、二十二碳六烯酸（DHA）占脂肪酸的73.38%，于桂芳[8]等采用HPLC 法对林蛙油中α-亚麻酸、亚油酸和油酸含量进行测定，其中亚油酸及α-亚麻酸是人体不可或缺的必需脂肪酸，该结果可为林蛙油的质量控制提供参考。除以上3 种成分外，EPA 和DHA 具有维持和改善视力，提高记忆、学习等能力，抑制老年痴呆症的生理学效果，对林蛙油质量标准的建立同样具有一定的参考意义。

1.4 类固醇

类固醇是一种广泛分布于动植物体内的天然产物，包括皮质激素、性激素、胆汁酸、胆固醇等。王永生等[9,10]对哈蟆油中的类固醇类成分进行分析，分离鉴定了胆固醇、十六烷酸胆甾醇酯、胆甾-4-烯-3-酮、胆固醇棕榈酸酯、胆甾-5-烯-3β，7β-二醇、3β-羟基胆甾-5-烯-7 酮，其中后两个成分为首次从哈蟆油中分离得到。徐阳[11,12]通过硅胶和Sephadex LH-20 凝胶柱层析结合制备液相和高速逆流法对哈蟆油成分进行分离，得到豆甾醇、菜油甾醇、胆甾-4，6-二烯-3-醇、7-去氢胆固醇、胆甾醇、7-羟基胆甾醇和7-酮基胆甾醇，它们的含量对哈蟆油药效有直接影响，故可用于哈蟆油鉴别。肖寄平等[13]从哈蟆油中鉴定了胆甾-3-酮、胆甾-3,5 二烯-7-酮、胆甾-4,6 二烯-3-酮、豆甾醇-22,23-二氢、胆甾-8-烯-7-酮等成分。胆甾-5-烯-3-β-醇、胆甾-3，6-二酮也被分离发现。此外林蛙油的多种药理作用均与性激素有关，目前已从林蛙油分离得到的性激素有雌二醇、美屈孕酮、乙酸雄甾酮、睾酮、孕酮等[14]。

1.5 其他激素

除性激素外，林蛙油中还含有其他种类的激素类成分，如前列腺素、甲状腺素（T3）、甲状腺旁素（T4）、促绒毛膜性腺激素等[15]。

1.6 维生素及微量元素

维生素与微量元素在林蛙油中含量较丰富。在林蛙油中已发现的维生素包括维生素A、B1、B2、C、D、E、K 以及β-胡萝卜素，其中维生素E 的含量最高，并且多种药理作用均与VE 有关[15]。目前利用电感耦合等离子体质谱仪( ICP-MS)、微波消解-电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-AES）、原子吸收光谱法、原子荧光光谱法、电感耦合等离子体质谱法、原子吸收分光光度法等技术，已从林蛙油中检测出K、Na、Ca、Mg、Fe、Zn、Mn、P、Al、Ba、Ni、Cu、Mo、Co、V、Cr、Pb、As、Se、Cd、Hg 21 种微量元素，有益元素K、Na、Ca、Mg、Fe、Zn、Mn 的含量均较高，而重金属元素As、Hg、Cr、Pb 含量较低，均未超出国家标准规定的限量值，这将为林蛙油的产品开发提供一定的参考价值[16,17]。

1.7 其他

磷脂是生物膜的主要脂质成分，林蛙油中含有磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂[18]；采用响应面优化法对林蛙油中核苷类成分肌苷和尿嘧啶提取工艺进行研究，为其他核苷类成分提取提供参考，也为林蛙油进一步开发提供依据[19]；2015 版《中国药典》将1-甲基海因作为鉴别成分，袁慧雅等[20]通过气相色谱-质谱法测定了不同动物类中药材1-甲基海因含量，其中蛤蟆油中1-甲基海因的含量为4.45μg·g-1。

2 林蛙油的鉴别

2.1 传统鉴别方法

2.1.1 基源鉴别 外形与青蛙相似，雌蛙体长为7～9cm。头部长与宽几乎相等，吻端略突出于下颌。鼻孔在吻眼之间，眼间距与上眼睑等宽，且小于鼻间距，前肢短而后肢较长，胫长度长于体长一半，有发达的蹼, 疣粒分散于胫跗关节前达眼两侧的褶间，成"V"字形在肩部排列，肤色根据季节发生变化，秋冬季节为褐色，夏季为黄褐色，腹面皮肤光滑，呈红黄色，有灰白色斑点块。背面与体侧有斑点分散，多数在疣点上，四肢有明显的横纹[21]。

2.1.2 性状鉴别 输卵管长为体长的4～8 倍，重量占体重的20%～26%，弯曲重叠呈不规则的块状或片状，并且大小不一，大者长度约1.5～2cm，厚约1.5～3cm，小者同米粒或豆粒大小。黄白色，毛细血管明显，脂肪样光泽，偶有灰白色薄膜状干皮和黑色卵。质硬而脆，易折断。温水浸泡膨胀度可达90%以上。膨胀后质地软呈棉团状，气腥，味微甘，嚼之有粘滑感[21]。

2.1.3 组织学鉴别

蛤蟆油横切面 卵圆形或阔卵圆形，颜色为灰紫色，具有较薄的表明结缔组织，并且有间断，支架明显，颜色呈粉红色，但折叠部位颜色较深；小叶呈长约2000μm，直径约150μm 的长方形；有明显的腺体细胞及细胞核，可见深紫色的毛细血管；内壁腺上皮细胞呈长径约40μm，短径约15μm 的卵形，粉红色，并且以数个为一组，切向排成一列；具有椭圆形的管腔。

蛤蟆油弦切面 有明显的结缔组织支架，并有血管贯穿其间，多角形的小叶，平均成五角形，长径120～250μm，短径70～200μm。6～8 个腺体细胞，排列成放射状，有明显的呈蓝紫色的细胞核[22]。

2.1.4 显微鉴别 刘娟等[23]取哈蟆油、青蛙油和蟾蜍油经过处理后，进行显微鉴别，通过对颜色，腺体纹理，腺体细胞形状、直径大小、排列，细胞壁形状、位置等的观察，对真伪哈蟆油进行鉴别。结果哈蟆油呈黄色或金黄色，腺体细胞长方形，直径25～75μm，细胞壁明显，核椭圆形，横断面呈管状，细胞三角形或梯形。青蛙油，腺体细胞多五边形，直径为37～86μm，细胞壁明显，细胞核横断面细胞类长方形。蟾蜍油，腺体细胞形态不一，直径为20～52μm，壁不明显，细胞核横断面呈类圆形。

2.1.5 水试鉴别 对哈蟆油、青蛙油和蟾蜍油依据膨胀度测定法测定。哈蟆油膨胀度为57，青蛙油膨胀度为45，蟾蜍油膨胀度仅为32[23]。

2.1.6 薄层色谱鉴别 采用薄层色谱法对哈蟆油、青蛙油和蟾蜍油进行对比，发现三者除都含有雌二醇、胆固醇和维生素A 外，分别含其他物质6 种、4种、3 种，其他成分区别明显，该方法可作为鉴别蛤蟆油的依据[23]。

2.1.7 荧光鉴别 张琴等[24]观察在荧光灯365nm波长下真伪林蛙油的显色情况，发现正品林蛙油显黄色荧光，伪品林蛙油显亮蓝色荧光。

2.2 仪器鉴别方法

2.2.1 紫外光谱法 利用紫外谱线组法，王永生等[25]绘制了蛤蟆油的紫外谱线组图谱，根据蛤蟆油、牛蛙油、青蛙油、蟾蜍油的石油醚提取液、三氯甲烷提取液、乙酸乙酯提取液、正丁醇提取液吸收峰的峰型、数量、位置的不同以达到鉴别蛤蟆油真伪的目的。

2.2.2 红外光谱法 王永生等[26]建立了不同产地正品蛤蟆油的红外指纹图谱，在1800～400cm-1范围内的指纹区吸收峰较多，特征性较明显，结果非常接近，所含主成分相似，利用此方法可以快速的对蛤蟆油进行鉴定、分析。

2.2.3 HPLC 指纹图谱法 黄玉明等[27]选取了15 批正品蛤蟆油及其伪劣品蛤蟆油，对它们的HPLC 图谱进行分析比对，计算每批蛤蟆油的相似度，其中15 批蛤蟆油中，11 批优质蛤蟆油相似度在0.886～0.972 之间，4 批劣质蛤蟆油相似度在0.56～0.802 之间，3 批伪蛤蟆油的药材相似度在0.64～0.724 之间。最终以相似度0.85 作为评价蛤蟆油合格的标准进行真伪鉴别。

2.2.4 RP-HPLC 指纹图谱法 Gan 等[28]采用反相高效液相色谱法和化学计量学分析相结合的方法，对正品林蛙油与其伪品牛蛙油、蟾蜍油和青蛙油进行鉴别，结果正品林蛙油的指纹图谱与伪品具有显著差异，正品林蛙油30min 左右开始出峰，30～80min内有12 个显著的共有峰，聚类分析正品聚为一类，主成分分析聚集于a 区。牛蛙油0～30min 内出现4个共有峰，蟾蜍油0～30min 内出现3 个共有峰，30～80min 牛蛙油和蟾蜍油都只出现5 个共有峰，青蛙油只出现4 个微小的共有峰；横坐标间隔为10 时，牛蛙油、蟾蜍油、青蛙油分别聚为一类，为25 时，正品聚为一类，3 个伪品聚为一类，牛蛙油、蟾蜍油、青蛙油分别聚集于b 区、c 区、d 区，与聚类分析结果一致。系统聚类分析（HCA）和主成分分析（PCA）成功地对正品林蛙油及其伪品进行区分。

2.2.5 凝胶电泳法 黄瑶等[29]分别采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）和十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）两种凝胶电泳法对及其类似品，伪品蟾蜍油、牛蛙油和青蛙油进行鉴别，结果两种方法得到正品林蛙油与伪品林蛙油的谱带在特征方面均有显著差异，且各有特点，Native-PAGE 法蛤蟆油可见6 条特征谱带，桓仁林蛙油具有6 条特征谱带，黑龙江林蛙油具有5 条特征谱带，蟾蜍油、牛蛙油和青蛙油的特征谱带数目分别为2 条、1 条和1 条。SDS-PAGE 法蛤蟆油可见11条特征谱带，桓仁林蛙油和黑龙江林蛙油均见11 条特征谱带，蟾蜍油、牛蛙油和青蛙油的特征谱带数目分别为5 条、6 条和6 条。两者均可用于区别哈蟆油与伪品，Native-PAGE 法还可区别哈蟆油与类似品黑龙江林蛙油。

2.2.6 凝胶电泳分离液相色谱质谱法 林燕等[30]建立了正品林蛙油及伪品特异性蛋白的鉴定方法，采用凝胶电泳分离、蛋白酶酶解、液相色谱分离、串联质谱检测、数据库检索等技术，筛选出特异性蛋白，从而有效的鉴别林蛙油的真伪。

2.2.7 基于聚类分析与多元统计分析的凝胶电泳法 李晶峰等[31]采用SDS-PAGE 法，对得到的不同批次东北林蛙油及其类似品黑龙江林蛙油、伪品中华蟾蜍油及牛蛙油的电泳图谱，进行聚类分析与多元统计分析，实现了对东北林蛙油及其类似品、伪品的准确分类及鉴别。

2.3 分子鉴定技术

2.3.1 快速PCR 法鉴别 何志一等[32]依据哈蟆油基因设计特异性PCR 引物，建立了蛤蟆油及其4 种混伪品的快速PCR 鉴别方法。采用碱裂解法提取每组样品DNA，并用Chelex-100 对所提取的基因组DNA 纯化，2 步循环PCR 反应，在所建立的方法下，正品显示明亮绿色荧光，混淆品没有荧光。

2.3.2 线粒体COI 序列的DNA 条形码技术鉴别 王孟虎等[33]利用DNA 条形码技术，建立了中国、东北、黑龙江和桓仁4 种林蛙的线粒体COI 基因数据库，根据种间遗传距离及种内变异位点，准确的鉴定了4 种林蛙及对不同地区的东北林蛙进行鉴别，此技术是哈蟆油基原动物鉴定的新手段。

2.3.3 环介导等温扩增技术（LAMP）检测及微流控芯片检测技术鉴别 王卫芳等[34]研究两种新型检测方法，LAMP 检测具有高速、低成本并且操作方便的特点。基于LAMP 技术产生的微流控芯片检测技术耗时短、灵敏度高、低耗能及低成本，更加便携化，两者有望成为分子生物学检测的新手段。

2.3.4 线粒体DNA cytB 鉴定 董瑶等[35]取市售雌蛙的新鲜组织及林蛙油，并提取总DNA，以cytB 为模板设计4 对引物，cytB 分别来自中国林蛙、东北林蛙、黑斑蛙及蟾蜍，利用PCR 技术扩增。结果发现所选市售林蛙组织及林蛙油均来自东北林蛙，该方法可为林蛙种属以及林蛙油基源的鉴定提供依据。

2.3.5 蛋白质翻译后修饰的差异性鉴别 金媛媛等[36]采用蛋白质印迹法检测东北林蛙油、黑龙江林蛙油和市售林蛙油中蛋白质的赖氨酸乙酰化、赖氨酸巴豆酰化和酪氨酸磷酸化水平，结果3 种林蛙油都出现可用于分析的蛋白质条带，并且在不同的修饰方法中，三者的蛋白条带信号强弱均有差异。赖氨酸乙酰化修饰水平在东北林蛙油中程度较高，市售风干林蛙油次之。赖氨酸巴豆酰化修饰水平在东北林蛙油程度较高，市售风干林蛙油次之。酪氨酸磷酸化修饰水平在市售风干林蛙油程度较高，东北林蛙油次之。该方法可为林蛙油的鉴别、质量评价及进一步开发利用提供依据。

2.3.6 同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）结合2D LC-MS/MS 技术鉴别 魏星华等[37]采用iTRAQ与质谱联用技术研究哈蟆油与青蛙油、蟾蜍油、牛蛙油的蛋白质组学，结合聚类分析、GO 功能注释和生物信息学分析结果，筛选出差异蛋白8 个，并且哈蟆油与各伪品间蛋白质组成差异较大。

3 展望

随着鉴别技术的不断发展，多种鉴别方法应运而生，不同的鉴别方法具有各自的特点，可根据实际情况选择鉴别手段。通过对传统鉴别、仪器鉴别和分子生物学鉴别方法的总结，可见分子生物学方法能够更加快速准确的对林蛙油进行鉴别，操作简便而高效。目前的检测方法对应的特征性成分基本都是蛋白质，成分指标比较单一，因此，应该进一步探索和发现林蛙油鉴别的特征性、专属性的其他物质。对于一种检测方法不能实现鉴别目的时, 应该继续开发检测技术, 或将多种方法联合, 结合多组分多指标对林蛙油进行检测，以解决林蛙油掺假、以次充好等问题，为林蛙油的鉴定以及质量标准的建立提供更好的方法。当然最重要的是，应该完善相关法律法规, 进一步提高公民的文化道德素养, 从源头上规避售假行为，维护市场健康发展。