WNT7A基因rs139790545多态性与汉族非梗阻性无精症的关系研究

傅文婷 张欣宗 钟兴明 赵文忠 李铭臻

(广东省计划生育科学技术研究所、国家卫生健康委员会、男性生殖与遗传重点实验室，广东 广州 510600 )

非梗阻性无精症是男性不孕不育的常见原因，目前其确切的原因尚不完全明确。近年来的研究显示，与精子形成、成熟有关的信号通路的功能异常或酶系的表达异常与非梗阻性无精症的发病有关[1.2]。Wnt信号通路是一种高度保守的信号通路，在人体发育及维持成人组织稳态中起到非常重要的作用，也是维持睾丸正常功能和精子成熟的重要信号通路[3.4]。WNT7A基因定位于3号染色体短臂2区5带，在睾丸组织中具有高表达，其可能参与睾丸正常的生理功能。rs139790545 是WNT7A的一个多态性位点，在目前的研究中尚位见到其与男性非梗阻性无精症相关联的研究报道，为进一步明确其在非梗阻性无精症发病中的作用，本文就rs139790545多态性与汉族男性非梗阻性无精症患者的发病的相关性进行研究，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择广东省计划生育科学技术研究所47例汉族非梗阻性无精症患者，患者年龄24～42(32.5±4.2)岁，入选标准：①患者诊断标准符合男性非梗阻性无精症的诊断标准；②患者自愿纳入研究。排除标准：泌尿生殖道感染性疾病、输精管堵塞、精索静脉曲张等。选择同期健康志愿者25例作为对照组，年龄27～43(33.1±4.1)岁，入选标准：①有正常生育史；②无家族性遗传性疾病；③无生殖系统肿瘤或其他疾病。2组年龄无显著差异，研究内容经研究所医学伦理委员会批准，符合医学伦理学要求。

1.2 主要试剂及仪器 TaqMan Genotyping Master Mix， SNPrs139790545G/A位点探针试剂盒，实时荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)，分光光度计(美国梅特勒-托利多集团公司)。

1.3 基因组DNA提取及定量 非梗阻性无精症患者及健康志愿者入选后，提取外周血DNA(酚/氯仿抽提法)，分别采集静脉血2ml，EDTA抗凝，双蒸水裂解红细胞，1700r/min离心，沉淀加入DNA裂解液重悬，加入蛋白酶温育30min，苯酚/氯仿/戊乙醇抽提，反复洗涤，去离子水重悬至20μ/L，分光光度计测量DNA的浓度及纯度。

1.4WNT7A基因SNP rs139790545位点基因分型 样本采用人基因组rs139790545 (C/A)多态性位点TaqMan探针分型试剂盒对多态性位点的基因型进行检测，ABI Stepone Plus RT PCR仪进行PCR扩增，反应体积10μl(DNA模板1.5μl，40(TaqMan SNP Genotyping AssayMix 0.25μl，2(TaqMan GenotypingMaster Mix5μl，DDH2O 3.25μl)，热变性温度95℃，时间10min，92℃，时间15s，退火温度60℃，时间1min，反应30个循环。StepOneSoftware v2.2软件分析荧光信号，通过散点图分析基因型。

1.5 统计学方法 数据分析采用SPSS22.0统计学软件，基因型及等位基因频率为计数资料，比较采用χ2检验，计算OR值及95%CI，HWE软件进行Hardy-Wenberg平衡检验，P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1WNT7A基因 rs139790545位点等位基因及基因型 对照组25名志愿者基因型分布符合Hardy-Wein-berg平衡(P=1.0)。非梗阻性无精症患者与健康志愿者之间rs139790545位点等位基因及基因型分布存在显著差异(P<0.05)，非梗阻性无精症患者A等位基因及AA基因型的发生频率高于健康志愿组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2WNT7A基因 rs139790545位点基因型与非梗阻性无精症的患病风险WNT7A基因 rs139790545位点基因型分析结果显示，基因型AA增加非梗阻性无精症的患病风险(0R=2.842，95%CI=1.776-3.988)，GG、GA基因型不增加非梗阻性无精症的患病风险(P>0.05)，见表2。

表1 梗阻性无精症患者和健康志愿者rs139790545位点等位基因及基因型分布

表2 WNT7A基因rs139790545位点基因型与非梗阻性无精症的患病风险

3 讨论

非梗阻性无精症是男性不育的原因之一，其根本原因是精子的形成或成熟障碍。在精子的形成和成熟过程中，有超过2000个基因参与，其中部分基因的多态性与精子的形成和成熟有关，其中任何基因发生突变，均可能导致精子的成熟障碍，最终导致男性不育症的发生。WNT基因家族是高度保守的序列，在不同物种上保持高度的同源性，主要通过和膜蛋白受体结合调控下游信号通路的活性，进而将细胞外信号传导到细胞内。其信号传递通过多种经典的信号通路完成，如WNT/β-catenin信号通、平面细胞极性通路、WNT/Ca+通路、PLC通路和PKC通路等，参与肿瘤细胞的增殖，精原细胞的分化及成熟等过程[5-7]。

近年来的研究显示，WNT7A基因在动物的性成熟、精子的形成以及胚胎发育中具有重要的作用。有研究显示[8]，多氯联苯能通过抑制女性生殖道中的WNT7A信号通路发挥雌激素效应，调节生殖道的发育，其中WNT7A信号通路的活性发挥着关键的作用。而且在精原细胞分化程度的过程中，也有WNT/β信号传导通路的调控作用[7]。在非梗阻性无精症的发病过程中，相关基因的多态性发挥着重要的作用，孙亚丽等人研究显示[9]，HLA-A抗原基因多态性与非梗阻性无精症的发病有关，其中携带HLA.26比01型基因增加发病的风险。王婵娟等[10]认为SRPA-IRPG基因rs6080550位点的多态性与发病有关，其中携带TT基因型的男性非梗阻性无精症的发病风险明显升高。也提示基因多态性在梗阻性无精症发病中的重要作用。研究显示[11]，在非梗阻性无精症患者中，睾丸WNT/β-Catenin信号通路异常，在非梗阻性无精子症男性间质细胞β-Catenin异常聚集，其可能与精子成熟障碍有关。另外一项研究显示，DKK3能够通过影响WNT/β-CATENIN信号通路的活性对精元细胞的发生过程进行调控。也说明WNT信号传导通路可能在非梗阻性无精症的发病中具有重要的作用。其中存在着对精子发生及成熟过程的基因位点，其对精子发生、成熟过程的调控，可能有基因多态性因素的参与。

rs139790545定位于WNT7A基因，通过研究发现，其第二外显子上存在基因多态性位点，通过基因分型发现，在梗阻性无精症患者和健康志愿者之间，其AA基因型表达频率存在明显差异，进一步的分析发现，WNT7A基因rs139790545位点的基因多态性与非梗阻性无精症存在关联，rs139790545位点携带AA基因型增加非梗阻性无精症的风险。

综上所述，WNT7A基因rs139790545位点多态性与非梗阻性无精症有关，AA基因型增加非梗阻性无精症的风险，其位点的基因多态性及基因突变可能是非梗阻性无精症的原因之一，由于结果仅为小样本研究，尚存在一定的局限性，尚需要在后续的研究中增加样本量，进一步证实研究结果的可靠性。