基于肿瘤动物模型病理学检测的实验教学设计

王敏，谷弘，王毅君，马岚

（兰州大学基础医学院基础医学实验教学中心，甘肃 兰州）

0 引言

肿瘤是临床常见疾病，具有高发病率和高死亡率的特点[1]。在医学本科实践教学中，由于肿瘤病程较长，以肿瘤患者为研究对象观察肿瘤的发生发展并进行病理诊断存在困难。因此，医学本科生对于肿瘤知识的学习主要是通过病理学大体标本及组织切片的观察来获取，或者在临床实习过程中，通过肿瘤患者临床表现、实验室检查结果进行学习。这样的知识获取过程，学生多以被动接受为主，往往缺少独力思考和强化训练的环节，对知识掌握不牢固、不灵活。

随着医学的进步发展，国家对新时代医学高等教育提出了更高的要求：“卓越医生教育培养计划2.0”提出了以胜任力为导向的教育教学改革[2]。目前国内很多医学院校进行了尝试，开设多种综合性实验以提升教学效果[3-8]。为了加强肿瘤基础理论与临床表现的联系，提高学生的临床思维和实践操作能力，设计了《肝癌小鼠模型的建立及病理学检测》形态学综合性实验，并融合多元化的思政元素，在实践中取得了较好的教学效果。

1 实验设计

实验项目包括肿瘤细胞体外培养、肝癌荷瘤小鼠模型建立、肿瘤组织病理学检测、结果分析及临床案例讨论。实验计划14 学时共4 周完成，第1 周肿瘤细胞培养4 学时，第2 周肿瘤动物模型的建立4 学时，中间间隔2 周对荷瘤小鼠的生长进行观察记录，第3 周荷瘤小鼠的病理学检测4 学时，第4周实验结果分析及临床案例讨论2 学时。

2 教学目标

2.1 基础理论知识的综合运用

要求学生掌握关于肿瘤的病理学知识，如肿瘤的致病因素、形态及对机体的影响等；熟悉正常肝脏的解剖学、组织学特点及正常生理功能；了解肝癌的病因、病理、临床表现、实验室检查等内容。将基础理论知识与临床课程的知识点融会贯通，培养学生知识整合能力。

2.2 实践操作技能的强化训练

要求学生掌握细胞传代培养、计数及活性检测，熟悉肿瘤动物模型的建立方法及荷瘤小鼠的观察指标，掌握病变组织的大体观察及取材、病理组织切片或涂片标本制备及染色方法，提高学生实践操作能力。

2.3 自主创新能力的培养

实验项目以学生为主体，中间设置开放环节，如接种细胞浓度的选择、化疗药物种类、浓度、药物作用时间的设置等，学生均以团队小组为单位进行资料查阅、实验操作、结果分析及临床案例的讨论，能够培养学生的团队协作精神及自主创新能力。

3 实验方法

3.1 实验试剂与仪器

3.1.1 实验动物及细胞株清洁级昆明种小鼠，18～22g，由兰州大学实验动物中心提供；小鼠H22 肝癌细胞株，购于中国科学院上海细胞库。

3.1.2 实验仪器CO2培养箱、超净工作台、倒置相差显微镜、小动物电子秤、病理取材台、体式显微镜、组织包埋机、石蜡切片机、生物显微镜及图像采集系统、酶标仪等。

3.1.3 实验试剂3%～5%苦味酸溶液、生理盐水、环磷酰胺、10%水合氯醛、乙醇、二甲苯、石蜡、10%中性福尔马林溶液、苏木素染液、伊红Y 染液、甲胎蛋白（AFP）检测试剂盒等。

3.2 肿瘤细胞准备

小鼠肝癌细胞株H22 用含10%FBS 的RPMI-1640 培养基，在37℃，5%CO2培养箱中培养。待细胞汇合度达到80-90%时，胰酶消化，台盼蓝染色计数，细胞活性良好，配置成浓度为1×107个/mL 的细胞悬液。

3.3 肝癌小鼠模型建立

3.3.1 实验分组及模型建立将实验小鼠随机分为空白对照组、皮下移植瘤组、腹水瘤组、实验性肺转移组及药物治疗组。荷瘤组实验小鼠分别于右侧腋部皮下、腹腔、尾静脉注射肿瘤细胞悬液0.2mL，构建皮下移植瘤、腹水瘤及实验性肺转移瘤小鼠模型，空白对照组小鼠相同部位注射生理盐水0.2mL。

3.3.2 荷瘤小鼠的药物治疗皮下移植瘤及实验性肺转移瘤模型小鼠在肿瘤细胞接种后24h，按30mg/kg 体重通过腹腔注射环磷酰胺溶液，隔天1 次，连续14 天。

3.4 荷瘤小鼠的一般观察

3.4.1 每日观察各组小鼠的精神状态、体毛、饮食、活动及粪便情况，称重并绘制小鼠体重生长曲线。

3.4.2 皮下移植瘤模型及相应药物治疗组小鼠每日观察接种部位有无感染，肿瘤生长后有无自然消退，待右侧腋窝皮下可触及结节后，每隔一天用游标卡尺测量肿瘤的最长径（a）和与其垂直的短径（b），根据体积公式V=1/2×a×b2（mm3）[9]计算荷瘤小鼠皮下移植瘤的体积，绘制肿瘤体积生长曲线。腹水瘤模型小鼠每日观察小鼠腹部变化，测量腹围，评价癌性腹水形成情况。

3.5 荷瘤小鼠病理学检测

3.5.1 荷瘤小鼠病理学大体观察实验小鼠麻醉后颈椎脱臼法处死。观察并记录肿瘤组织的分布、形状、质地、界限、长短径、重量、与周围组织的粘连情况；观察荷瘤小鼠各脏器的表面是否有结节，称重；抽取小鼠腹水，观察其颜色和体积；并与对照组小鼠进行比较[10]。大体观察结束后将小鼠腹部进行缝合，实现对实验动物的人文关怀。

3.5.2 组织切片、腹水涂片的制作及HE 染色肿瘤组织及小

鼠脏器经固定、取材、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片等过程，制成石蜡切片。腹水抽取后滴于载玻片上制成腹水涂片。常规苏木素-伊红染色，封片。

3.5.3 镜下观察生物显微镜下观察荷瘤小鼠肿瘤组织及各脏器的组织结构和细胞形态，从低倍到高倍。通过观察对照组小鼠各脏器的组织切片，比较正常组织与病理组织形态的差异。

3.6 荷瘤小鼠的肿瘤标志物检测

各组小鼠麻醉后眼眶取血法收集血液标本，置于枸橼酸钠抗凝管中，室温2000 rpm/min 离心15min，收集血浆待用。采用ELISA 双抗体夹心法，操作严格按照AFP 检测试剂盒说明书进行，测定实验小鼠血浆AFP 水平。

3.7 临床案例讨论

通过对某临床案例中患者的临床表现、实验室检查指标进行分析，观察病理大体标本和镜下切片，明确该患者的病理诊断，分析该患者出现上腹疼痛、消瘦、腹水等症状体征的原因；讨论该患者的疾病病程。使学生掌握肝癌的临床表现和实验室阳性指标，熟悉肝癌的转移途径、诊断及鉴别诊断。

4 实验结果讨论

4.1 实验小鼠体重生长情况观察

不同实验组小鼠体重变化如图1 所示。结果显示，各对照组小鼠体重随着时间缓慢增加，但皮下移植瘤组和实验性肺转移组小鼠的体重在缓慢增加后又逐渐降低，提示可能随着肿瘤的发展，肿瘤影响小鼠机体功能，导致其体重减轻。药物治疗组与对照组小鼠相比，虽然也有体重减轻，但是均高于荷瘤组，表明药物治疗能够减缓荷瘤所致的小鼠体重降低。此外，腹水瘤模型组小鼠体重增长明显快于对照组，可能是由于癌性腹水的快速增长，导致小鼠体重的相对增加。

图1 各组实验小鼠体重生长曲线

4.2 荷瘤小鼠肿瘤生长情况观察

实验小鼠的肿瘤生长情况如图2 所示。皮下移植瘤模型小鼠在肿瘤细胞接种后4-5 天皮下可触及肿瘤结节，肿瘤体积随着时间逐渐增大；当使用环磷酰胺治疗后，皮下肿瘤结节的体积显著小于未治疗组，表明化疗药物治疗能够减缓肿瘤的生长。腹水瘤小鼠的腹围能够代表癌性腹水的产生情况，结果提示，与对照组相比，腹水瘤模型小鼠腹围随着时间显著增加。

图2 各组实验小鼠肿瘤生长情况

4.3 荷瘤小鼠肿瘤组织的病理学检测

对各组实验小鼠的肿瘤组织及脏器进行大体及镜下观察，部分结果如图3 所示。皮下移植瘤模型小鼠腋下接种部位可见突出皮肤的肿物形成，切开皮肤可见完整的瘤体组织，药物治疗组小鼠的瘤体组织明显小于未治疗组。经HE 染色后光镜下观察，可见肿瘤细胞排列紊乱，大小形态不一，核浆比例失调，细胞核形态不一，核大深染，可见巨核、双核现象，并伴有坏死组织及炎性细胞浸润。剥取实验性肺转移组小鼠的肺组织在体视显微镜下观察，可见对照组小鼠肺组织表面光滑，荷瘤组小鼠肺表面出现部分直径为2-3mm 的小结节。肺组织切片观察对照组未发现肿瘤组织，荷瘤组出现大片癌组织，呈团块状分布。腹水瘤模型小鼠腹水涂片结果显示，肿瘤细胞大小形态不一，核浆比例失调，核大深染，符合肝癌H22 细胞的形态。

4.4 荷瘤小鼠血浆AFP 水平检测

酶联免疫吸附法检测实验小鼠血浆AFP 水平，结果显示与对照组相比，三种模型小鼠血浆AFP 水平均显著升高，药物治疗组小鼠血浆AFP 水平低于荷瘤组，提示化疗药物治疗能够减缓由于荷瘤所致的小鼠血浆AFP 含量增加（见表1）。

表1 实验小鼠血浆AFP 水平（±s）

表1 实验小鼠血浆AFP 水平（±s）

注：NA 表示无相关数据

皮下移植瘤模型（ng/mL） 实验性肺转移瘤模型（ng/mL） 腹水瘤模型（ng/mL）对照组 1.26±0.07 1.28±0.06 1.29±0.04荷瘤组 3.97±0.22 3.63±0.11 2.65±0.13药物治疗组 2.66±0.16 2.93±0.08 NA

图3 荷瘤小鼠肿瘤组织形态观察（HE 染色，Bar=50µm）

5 实验教学效果

本实验通过建立肿瘤动物模型，学生不仅能够观察肿瘤的大体标本和组织切片，而且可以直观的观察肿瘤的生长与转移情况，从而更立体化的理解肿瘤的发生发展过程，巩固病理学相关知识内容。通过临床案例讨论，将基础理论与临床表现有机结合，学生通过观察荷瘤小鼠的一般情况，能够更深层次的理解肝癌患者临床症状、体征如消瘦、腹水、恶病质等的产生原因。通过荷瘤动物的病理学检测，使学生们掌握临床病理常用检测方法，不仅强化理论教学，更促使学生从被动学习转向主动学习，开拓科研思维，增强实践操作能力。此外，对实验动物麻醉后处死及大体观察后进行缝合等实验操作细节，有机融合实验动物伦理学的相关内容，能够培养学生对实验动物的人文关怀。

6 结语

细胞培养、动物模型建立及病理检测这些均是医学基础研究或临床中常用的实验技术。本综合性实验设计以上述实验方法为载体，有机整合细胞生物学、病理学、免疫学、实验动物学和内科学的相关教学内容，使实验教学紧密结合医学发展前沿。这样的实验设计，注重功能、代谢、形态改变与临床的内在联系，能够帮助学生构建系统的思维方式，加强其综合创新能力，培养能够运用交叉学科知识解决未来医学领域前沿问题的高层次医学创新人才。