介孔二氧化硅载体在酶蛋白固定化中的应用

董思圳，秦 风，贾文敬，李 欢，董宛阡，李 林，黄建忠，舒正玉

(福建师范大学生命科学学院 工业微生物发酵技术国家地方联合工程研究中心，福建 福州 350108)

介孔材料是指孔径介于2～50 nm之间的多孔材料，按其化学成分可分为介孔硅(如介孔SBA-15)、介孔金属氧化物(如介孔氧化铁，介孔氧化铅)[1]、介孔金属硫化物(如硫化锗)[2]、介孔碳(如碳分子筛)[3]和介孔聚合物(如三嵌段共聚物FDU-15、FDU-16)[4]等。介孔材料表面可携带各种官能团，用于固定不同功能的活性分子。其中，介孔二氧化硅载体由于具有低毒、低成本、生物相容性好、化学惰性和热稳定性优良等特点，被广泛应用于药物载体、酶载体等领域。近年来，不同形状、孔径、粒径、比表面积、疏水性及携带多种功能基团的各种介孔二氧化硅载体相继被制备出来，并表现出优良的性能。

绿色催化工艺被广泛应用于生物质能源、手性药物、可降解高分子材料合成等领域，催生了对各种固定化酶制剂的需求。为开发操作稳定性好、催化效率高的固定化酶制剂，科研工作者进行了大量的尝试，选择各种材料作为酶蛋白载体，包括早期的大孔树脂、硅藻土到现在的各种纳米材料等，其中，介孔二氧化硅是应用较为成功的载体之一。截至目前，介孔二氧化硅已成功应用于水解酶、氧化还原酶等酶蛋白的固定化，并展现出优良的催化性能。

1 介孔二氧化硅载体对酶蛋白的固定化效果

1.1 介孔二氧化硅固定化水解酶

包括脂肪酶(lipase,EC 3.1.1.3)、蛋白酶(protease,EC 3.4.21.112)、各种糖苷酶(EC 3.2.1.24)等在内的水解酶(hydrolase,EC 3)家族的酶蛋白，是最早成功应用于工业化催化生产、最早实现商业化制备的酶蛋白。水解酶能在生物柴油、燃料乙醇等生物质能源、手性药物的绿色合成及精细化工等领域实现大规模的应用，并表现出优良的催化性能，其重要因素是各类固定化酶制剂的成功开发。Díaz 等[5]通过物理吸附首次将木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和细胞色素C固定在孔径为4.0 nm的介孔二氧化硅MCM-41上。分子量较大的化合物，如聚-L-赖氨酸能显著抑制游离胰蛋白酶水解N-α-苯甲酰基-DL-精氨酸-4-硝基苯胺的催化活性，残留酶活仅为15%；但在相同条件下，固定化胰蛋白酶的残留酶活高达68%。Jiang等[6]以单宁酸为造孔剂调整孔径大小，制备了平均孔径为(195±16) nm的介孔二氧化硅，并通过物理吸附固定伯克霍尔德菌脂肪酶Lip A，该固定化脂肪酶表现出良好的热稳定性(70 ℃仍能保持90%以上的残留酶活)和广谱有机溶剂耐受性(对甲醇、乙醇、异辛烷、正己烷和四氢呋喃均表现出良好的耐受性)，能催化生物柴油的合成，转化率可达到92%。Palanivelu等[7]利用介孔二氧化硅SBA-15吸附乙酰胆碱酯酶(AChE)后，进一步用戊二醛进行交联，固定化乙酰胆碱酯酶作为生物传感器用于检测农药残留。结果表明，SBA-15固定化乙酰胆碱酯酶稳定性显著提高，达到60 d以上。Sannino等[8]利用三乙氧基硅丙基异氰酸酯将β-葡萄糖苷酶共价锚定到介孔二氧化硅纳米材料上，固定化β-葡萄糖苷酶较游离酶的热稳定性提高了20 ℃。

为了方便固定化酶制剂的回收，越来越多的磁性介孔二氧化硅应用于水解酶的固定化。Poorakbar等[9]将纤维素酶共价固定到自制的磁性金介孔二氧化硅纳米核壳(mAu@PSNs)上，通过红外光谱证实了纤维素酶与mAu@PSNs成功结合，Bradford法测定蛋白质结合率为76%；以Whatman滤纸为底物，该固定化酶在9 h后仍能保持58%的初始活性。Ali等[10]制备了中孔(20～50 nm)介孔二氧化硅磁性材料，并用于固定皱褶假丝酵母脂肪酶，中孔介孔二氧化硅的载酶量可达797 mg·g-1，比活力高达1 503 U·g-1。

此外，一些高分子材料也被应用于介孔二氧化硅载体的修饰。Özbek等[11]通过原位聚合技术将丙烯酸和壳聚糖混合物包被介孔二氧化硅，制备出高分子聚合物包被的介孔二氧化硅纳米材料，并成功应用于枯草杆菌蛋白酶的固定化。相对于游离酶，固定化蛋白酶的热稳定性提高了10 ℃。Xiang等[12]制备了壳聚糖包被的介孔二氧化硅SBA-15复合材料，并用于固定猪胰脂肪酶，结果表明，相对于未用壳聚糖修饰的介孔二氧化硅SBA-15，复合材料的载酶量提高了20%，比活力提高了70%。

1.2 介孔二氧化硅固定化氧化还原酶

在高分子材料的绿色合成、环境污染物的生物降解、生物燃料电池的制造、医学组织工程和生物传感器的开发等领域，常常涉及到氧化还原酶介导的各种氧化还原反应。在利用介孔二氧化硅固定氧化还原酶的实例中，葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4)和辣根过氧化物酶(EC 11.1.7)常作为模式氧化还原酶，以评价固定化效果。Pitzalis等[13]制备了有序介孔二氧化硅，并用于葡萄糖氧化酶/辣根过氧化物酶的共固定化。在该双酶共固定化体系催化的偶联反应中，氧化咖啡酸和阿魏酸的转化率可达70%。Lei等[14]使用一种树突状介孔二氧化硅材料固定辣根过氧化物酶。与商用ELISA试剂盒相比，固定化辣根过氧化物酶的血清检测灵敏度提高了2 000倍。Escuin等[15]使用一系列的介孔二氧化硅纳米材料(SBA-15、SBA-3和MCM-48)固定多酚氧化酶。结果表明，所有固定化材料的载酶量均在pH值为4时达到最高(100 mg·g-1以上)，其中SBA-15更高达320 mg·g-1。

1.3 介孔二氧化硅固定化其它酶

除了水解酶和氧化还原酶，介孔二氧化硅也可作为其它酶蛋白的固定化载体。Göβl等[16]制备了一种大颗粒(直径100 nm)中孔(7 nm)介孔二氧化硅，并应用于碳酸酐酶和辣根过氧化物酶的固定化。两种固定化酶制剂分别催化2-甲氧基酚显色反应和4-硝基苯乙酸酯水解反应，均表现出优良活性。Nara等[17]通过物理吸附将嗜热地衣芽孢杆菌丙氨酸消旋酶固定到中孔(4.0～8.5 nm)介孔二氧化硅上，固定化酶表现出更高的热稳定性(游离酶80 ℃下活性半衰期为20 min，固定化酶为60 min)和高效的重复利用性(重复使用5次后仍可保持50%的残留酶活)。

2 影响介孔二氧化硅载体固定化酶蛋白效果的因素

2.1 孔径与粒径

介孔二氧化硅材料的基本性质是影响其固定化效果的关键因素，其中孔径、粒径、比表面积等因素对载酶量起决定性作用。通常认为，介孔二氧化硅载体的孔径应稍大于酶蛋白的直径。在相同孔径的情况下，粒径越大则越容易造成孔隙塌陷，粒径越小则孔隙越少即孔隙率越低。一个理想的固定化酶介孔材料需要在载酶量、孔径和孔隙率之间找到一个平衡点。Kalantari等[18]制备了可调节孔径(1.6～13.0 nm)的介孔二氧化硅材料，并应用于固定假丝酵母脂肪酶，载酶量达711 mg·g-1；进一步研究发现，提高载体的疏水性，有助于提高固定化脂肪酶的催化活性。

2.2 有序介孔和无序介孔

有序介孔二氧化硅的制备主要利用特定类型的有机硅前驱体和结构导向剂(如两亲性表面活性剂和生物大分子)的自组装。无序介孔材料的制备方法通常分为两种：在有序介孔材料的孔隙中接枝功能基团或者在制备介孔材料时直接加入有机溶剂(如1,3,5-三甲苯)，以达到扩宽部分区域孔径的目的。有序介孔材料简单易制备，孔径分布规则均匀适合单酶固定；无序介孔材料虽然复杂但可调节的因素更多，应用更加广泛。Califano等[19]制备了一种中心径向孔分层结构的介孔二氧化硅材料，并应用于固定β-葡萄糖苷酶，固定化β-葡萄糖苷酶显著提高了酶对底物的亲和性(游离酶km=5.4 mmol·L-1，固定化β-葡萄糖苷酶km=4.3 mmol·L-1)。Tahmasbi 等[20]先用四乙氧基硅烷(TEOS)和溴代十六烷基三甲胺(CTAB)制备了介孔二氧化硅，再用3-氨基丙基三乙氧基硅烷进行功能化修饰并接枝，最终获得的介孔二氧化硅平均粒径小于100 nm，并利用该材料固定脱氧核糖核酸酶、凝固酶和α-淀粉酶。结果表明，固定化酶具有抗革兰氏阳性菌(枯草杆菌和金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌和铜绿假单胞菌)的功能。

2.3 表面化学修饰

对介孔二氧化硅材料表面进行化学修饰，丰富载体表面基团的类型，有助于提高其作为固定化载体的载酶量，优化固定化酶制剂的性能。Harmoko等[21]制备了乙酰基修饰的介孔二氧化硅纳米材料，并应用于纤维素酶的固定化，固定化纤维素酶的酶活提高了56倍。Gao等[22]制备了经多巴胺修饰的介孔二氧化硅纳米材料，并应用于念珠菌脂肪酶的固定化，固定化念珠菌脂肪酶贮存30 d后，残留酶活仍保持在64%。Ahmadi等[23]使用N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷对磁性介孔二氧化硅进行功能化修饰得到复合材料，用于固定α-淀粉酶，利用该固定化酶催化溴苯与苯硼酸的偶联反应，转化率提高至98%，且反应时间缩短至0.17 h。Mosafa 等[24]利用(3-氯丙基)三甲氧基硅烷修饰二氧化硅包裹的磁性纳米粒子得到复合材料，用于固定木瓜蛋白酶。与游离酶相比，固定化木瓜蛋白酶在处理石榴汁浊度时重复使用8次后，残留酶活仍保持在50%以上。

2.4 其它因素

影响介孔二氧化硅载体固定化酶蛋白效果的因素还包括pH值、造孔模板、制备工艺等。Díaz等[5]使用介孔二氧化硅MCM-41对球形酶、细胞色素C、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶进行固定化，发现pH值对载酶量具有显著影响，pH<7时能显著提高木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的载酶量；而pH>7时细胞色素C的载酶量显著提高。Venezia等[25]以单宁酸为造孔剂制备了改性介孔二氧化硅，并用于固定β-葡萄糖苷酶。游离酶在60 ℃下仅保持55%活性，而固定化β-葡萄糖苷酶在60 ℃下仍保持100%活性。Dai等[26]以菠萝皮羧甲基纤维素、聚乙二醇和介孔二氧化硅SBA-15为原料，采用反复冻融法制备了水凝胶复合材料，并用于固定木瓜蛋白酶。在80 ℃下孵育2 h后，固定化木瓜蛋白酶保留了56%的初始活性，而游离酶仅保留了16%的初始活性；贮存10 d后，固定化木瓜蛋白酶保留了79%的初始活性，而游离酶仅保留了27%的初始活性。

3 结语

随着制备工艺的日趋成熟和完善，越来越多新型的介孔二氧化硅材料被开发出来。如Li等[27]开发了一种简便、改进的双相制备方法，通过调节表面活性剂和两亲性试剂的浓度及协同作用，可快速制备出孔径(6.1～11.4 nm)大小可调控的、开放的核壳磁性介孔二氧化硅微球。同时，介孔二氧化硅材料表面修饰的化学基团种类也越来越多，其拓展的应用领域也必将越来越广。

作为一种制备简单、生物相容性和安全性良好、孔径可控、比表面积大的多孔材料，介孔二氧化硅越来越广泛地用作各种酶蛋白的固定化载体，并取得较好的应用效果。目前，介孔二氧化硅更多地应用于单酶固定化，随着多酶偶联催化反应的兴起及广泛应用，如何实现多种酶蛋白在介孔二氧化硅表面的有序组装(或自组装)依然存在挑战。