缺氧诱导因子-1改善急性脊髓损伤后神经功能恢复研究进展

张安瑞，杨彦玲，刘敏丽

(延安大学医学院，陕西 延安 716000)

0 引言

近年来，脊髓损伤因严重危害人类健康而受到越来越多的关注。尽管其发病率较常见疾病低[1]，但由于其无有效的根治方法及并发症、后遗症严重，致残率和致死率高，成为临床实践中一大难题[2]。因此，为该类患者寻找有效的治疗方法迫在眉睫。目前，临床医师主要通过手术方式解除脊髓在受损后继续受到压迫及给与相应药物以缓解症状治疗该病，但中枢神经系统神经元在受损后不能再生，且脊髓损伤发病机制复杂，多种致病因子参与其中，使临床治疗收效甚微[3]。目前，随着神经干细胞技术趋于成熟，该技术也成为了治疗中枢神经系统损伤的热点[4]。尽管如此，我们对于脊髓损伤的发病机制仍不完全清楚。脊髓损伤分二类，即原发性损伤和继发性损伤。现有研究表明，继发性脊髓损伤是多种因素共同作用的结果，如水肿、缺血缺氧、炎症反应、自噬和细胞凋亡等。其中，缺氧诱导产生的HIF-1是影响脊髓损伤患者预后及病情发展的重要因素[5]。在脊髓损伤中，HIF-1通过激活一系列下游因子改变受损细胞的代谢、对外界不良因素的耐受状态等发挥保护作用，以促进脊髓损伤后的功能恢复及预后[6]。目前，也有学者发现HIF-1可以激活5-羟色胺促进轴突再生[7]。本文将对HIF-1在脊髓损伤中的调节功能进行综述。

1 脊髓损伤的分类

1.1 原发性损伤

原发性损伤的形成是脊柱在机械性外力、撞击或坠落作用下发生断裂或移位，脊椎碎片使位置较固定的脊髓受到直接创伤或挤压，导致脊髓局部或多发性结构损伤[8]，引起脊髓功能障碍。目前的临床治疗手段还不能对该过程的损伤进行有效干预。

1.2 继发性损伤

继发性损伤是原发性损伤后发生的由多种因素介导的神经细胞进行性病理改变。主要影响因素如下：

1.2.1 水肿

水肿包括血管源性、细胞毒性和二者兼有的混合性三种。血管源性水肿是由于血管内皮细胞受损、血脊髓屏障遭到破坏，致使液体从血管内流到血管外进入组织间隙引起水肿，进而压迫脊髓加重脊髓损伤[9]。当水在各种诱因下大量积聚于神经元细胞和星形胶质细胞内，是细胞毒性水肿产生的主要原因，细胞水肿会破坏细胞的微环境[10]，并且可以进一步加重血脊髓屏障的破坏。有研究表明，脊髓损伤后，星形胶质细胞的水通道蛋白4可以介导水分进入细胞参与细胞毒性水肿过程[11]。血管源性水肿和细胞毒性水肿相互影响、相互作用，最终形成水肿恶性循环，对机体造成严重危害。水肿与脊髓损伤的预后明显相关。有研究表明[12]，脊髓水肿越重，患者预后越差。因此，对于水肿的有效干预成为我们治疗脊髓损伤亟待解决的关键。

1.2.2 缺血、出血、缺氧脊髓受损后，缺血及出血在疾病的进展中发挥了重要作用。缺血、出血使受损部位的脊髓灰质及白质发生明显低灌注，严重影响细胞能量代谢障碍[13]，同时缺血会促进血栓形成，血栓形成在微小血管内多见，此时供血大动脉血栓形成可能并不显著[14]，血栓形成后严重影响了受损部位及血管远端部位的血流灌注，继而引发了水肿、炎症等不良反应。Anthony, B等发现[15]，脊髓损伤后，核磁共振检查显示受损部位脊髓出血几乎总是与水肿同时出现。血管损害也使得脊髓更容易受到炎症细胞、细胞因子、血管活性肽等因素的侵袭[16]，进一步加重了脊髓损伤。缺血、出血也会引起相应部位发生缺氧改变，导致缺氧相关病理事件发生，对脊髓功能恢复产生不利影响。

1.2.3 炎症炎症在继发性损伤中发挥了至关重要的作用。在继发性损伤中，小胶质细胞、内皮细胞和室管膜细胞内的多数促炎性细胞毒性因子如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-α)、白细胞介素-1β(Interleukin，IL-1β)和白细胞介素-6(Interleukin，IL-6)等释放增多，是创伤后炎症反应的关键介质[17]。这些炎症介质的释放量与脊髓损伤的严重程度有关。其中，对于TNF-α的研究发现，其在损伤急性期内对机体有害，但在慢性期内却对机体有利[14]，说明TNF-α的表达具有时序性，这也在治疗炎症方面提供了有力证据。TNF-α主要通过其受体超家族发挥促炎症作用，其受体包括肿瘤坏死因子受体1和受体2[18, 19]，现在普遍认为TNF的促炎症效应主要是通过肿瘤坏死因子受体1实现的，而肿瘤坏死因子受体2起辅助增强炎症的作用[20]。TNF-α在脊髓损伤中不仅发挥促炎作用，而且与神经损伤后引起相应部位的疼痛密切相关[21]，此时，TNF-α受体主要通过激活电压门控钠通道使得疼痛发生[22]。除了经典的炎症反应因子外，有研究者发现，载脂蛋白E4是控制炎症介质释放的重要蛋白[23]，其含量升高后，炎症介质TNF-α和白细胞介素-6也明显升高，促进炎症反应的发生[24]。尽管有促炎因子大量释放，但有些因子对炎症反应具有明显的抑制作用，如白细胞介素-10[25]。白细胞介素-10主要由M2型巨噬细胞分泌，它通过下调促炎因子、提供营养支持、促进功能恢复等抑制炎症反应，但不能忽视的是，白细胞介素-10不能通过血脊髓屏障且在损伤部位容易被清除，这种特性使得其抑炎作用受到了明显的限制[26]。促炎因子与抑炎因子共同参与机体内的炎症级联反应，影响脊髓损伤患者的预后。

1.2.4 自噬也在脊髓损伤中发挥了重要的作用[27]。脊髓损伤后，自噬过程被激活，通过将受损和衰老细胞的细胞质成分在自噬体中隔离和消化，以清除细胞碎片，起到稳定微环境的作用[28,29]。与自噬相关的重要标记物有2个，即LC3和Beclin1。因为LC3可以调节自噬体的发育，所以广泛用作自噬体标记物。Beclin1通过与B淋巴细胞瘤-2基因相互作用的蛋白结合在促进自噬中起着重要作用。自噬主要通过mTOR信号通路或增强Beclin-1的表达来抑制脊髓机械性损伤神经元的凋亡[30]，这说明虽然自噬可以吞噬降解破坏后的细胞，但它同时保护神经元不被降解，并抑制自噬晚期神经退行性变[31,32]。所以，在应激情况下，自噬对于促进细胞存活至关重要[33]。自噬通过抑制缺氧时细胞凋亡，促进细胞增殖和分化，从而促进内皮祖细胞的存活，内皮祖细胞的正常增殖和分化对缺血部位血管生成至关重要。另外自噬可与机体的免疫相关信号通路相互作用调节炎症反应介质的分泌以控制机体内的炎症反应[34,35]，并且部分调节炎症反应的介质如I-κBα直接通过自噬溶酶体途径进行降解[36]，这说明自噬和炎症反应间具有密切联系，但自噬影响炎症的具体机制目前尚不清楚。尽管自噬的主要作用是保护细胞，但自噬过度会对细胞产生不利影响[37,38]。

除了以上几大因素外，继发性损伤中还有电解质紊乱、自由基形成、细胞凋亡等重要因素参与其中[39,40]，这些因子相互作用，共同导致脊髓严重的病变。脊髓损伤发生后，如果不给予积极治疗，高血压、糖尿病、肥胖和骨质疏松[41]等并发症发生率增高，患者生活质量明显下降。

2 缺氧及其影响

缺氧不仅是血管疾病的结果，而且可以反作用于血管促成多种血管病理状态的形成，包括动脉粥样硬化、主动脉瘤、肺动脉狭窄和慢性静脉疾病[42]等。有研究发现缺氧在脊髓损伤部位是存在的，并且呈不均匀分布，这可能是由脊髓损伤后血管破裂导致受损部位缺血、缺氧发生[43]。近几年，有结果表明，吸入低浓度的氧气成为一种治疗脊髓损伤安全和行之有效的方式，它可以调节残存神经元神经可塑性促进脊髓损伤后运动功能恢复，但是，如果对氧气浓度和吸入低氧的时间把控不佳的话，将会导致机体多系统严重的病理损害[44,45]。

2.1 HIF-1

低氧调节脊髓损伤后神经可塑性过程中产生的最重要的因子是HIF-1，其表达量在缺氧后明显升高。HIF-1是一种重要的转录因子，在众多的转录因子超家族中对维持细胞氧稳态具有重要作用。HIF-1是由受氧浓度变化调节表达的1α和在机体内稳定表达的1β组成的二聚体[46]，前者是发挥功能的主要部分，后者起结构支持作用。HIFα有三种亚单位，即HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α。HIF-1α在所有有核细胞中均有表达，HIF-2α的表达局限于特定的细胞类型，包括血管内皮细胞、肾间质细胞、肝细胞、心肌细胞和星形胶质细胞[47]。已经有研究表明，在受损的运动神经元中，HIF-1α的表达明显增多，而HIF-2α的表达量仍在正常未受损的范围内[48]，这也与它们的组织及细胞表达差异相吻合。尽管二者的表达有组织/细胞特异性，但可以肯定的是二者均是受氧浓度调节的转录因子。对于HIF-3α的认识还不十分清楚，目前已知的是HIF-3α的基因表达产物主要作为HIF-1α和HIF-2α活性的负调节因子和靶基因的转录激活剂，可以减弱机体适应缺氧的能力[49,50]。

2.2 HIF-1α在不同氧浓度下的改变

HIF-1α的稳定性和转录活性均会受到氧依赖性羟基的负性调节。在常氧条件下，HIF-1α亚基被活化的脯氨酸羟化酶羟基化[51]。HIF-1α脯氨酸残基的羟基化对于HIF-1α与肿瘤抑制因子(VonHipple-lindauDisease，vHL)的结合至关重要，因为vHL与elongin C相互作用后会促进泛素化酶复合体的形成，进而促进HIF-1α的泛素化改变和蛋白酶体降解[52]。pVHL是E3泛素连接酶的底物识别亚单位，当有氧存在时，可以引导HIF-1α亚单位进行蛋白酶体降解[53]。

而在缺氧条件下，HIF-1α的脯氨酸残基不被羟基化，不与pVHL结合，而与HIF-1β结合[52]，形成二聚体后转移向细胞核内与机体内适应缺氧有关基因的缺氧反应元件结合，使血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial cell growth factor，VEGF)和血小板源性生长因子、葡萄糖转运蛋白等表达增多进而促进血管生成和无氧代谢[54]。pVHL与HIF-1α的相互作用是氧依赖的，因为HIF-1α必须由氧敏感的脯氨酰羟化酶家族成员在两个保守的脯氨酰残基上进行脯氨酰羟基化，才能与pVHL结合[55]。有证据表明，当脯氨酸羟化酶的表达被抑制时，HIF-1α的表达量会明显增多[56]。二甲基草甘氨酸是脯氨酸羟化酶的有效抑制剂，当给予脊髓损伤患者一定剂量的二甲基草甘氨酸后，其通过抑制脯氨酸羟化酶表达，激活HIF-1α表达，产生一系列下游因子以抵抗氧化应激、调节细胞自噬、抗凋亡等改善脊髓损伤[57]。

HIF-1α除了受到脯氨酰羟基化作用外，还通过一种重要的缺氧诱导因子抑制性因子而使天冬酰胺残基羟基化[58]。在缺氧条件下，天冬酰胺基羟基化通过阻断反式激活结构域与辅活化因子p300 的相互作用，从而负向调节HIF-1α的反式激活活性，此时，脯氨酸羟化酶的氧依赖性羟基化活性被抑制[59]。这使HIF-1α免于降解破坏，在细胞核中与HIF-1β聚合形成二聚体，并与其靶基因的缺氧反应元件结合，激活其下游因子发挥作用[60]。

2.3 HIF-1的靶基因产物

2.3.1 VEGF血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Cell Growth Factor, VEGF)是一种与血管生成密切相关的蛋白质，它与VEGFR结合发挥作用，其受体主要包括VEGFR1和VEGFR2VEGFR3三种[61,62]。VEGFR-1和VEGFR-2主要在血管内皮细胞中表达。VEGFR-3在血管内皮和淋巴管内皮细胞上表达。VEGF可以促进损伤部位血管生成和神经再生以改善局部损伤缺血微环境而作为治疗脊髓损伤的重要基因，Yun,Y.等发现在缺氧条件下，VEGF表达量比对照组明显增多[63]，这成为该基因治疗脊髓损伤的基础。并且VEGF可以保护运动神经元免于自由基、缺氧/低血糖、谷氨酸兴奋性毒性[64,65]及细胞凋亡等因素带来的不利影响。VEGF在起保护作用时部分是通过激活自噬和抑制炎症反应实现的[66]，有研究发现，给脊髓损伤实验组小鼠给予外源性VEGF后，与自噬相关的指标—Beclin1 and LC3B—明显升高，而与炎症反应相关的因子，如IL-1β、 TNF-α and IL-10[67]则明显下降。所以，在缺氧时HIF-1α通过激活VEGF促进损伤部位血管生成及减少轴突相关蛋白降解且促进轴突再生[68]以发挥其保护作用。

2.3.2 GLUT葡萄糖是机体能量供应的主要来源物质，中枢神经系统对能量缺乏的耐受力最差，因为其不能进行无氧糖酵解，其能量供应主要来自葡萄糖有氧氧化，所以在缺氧的情况下，机体内葡萄糖进行糖酵解，进入三羧酸循环的葡萄糖减少，导致体内各种代谢尤其是中枢神经系统代谢紊乱，继而发生明显的功能紊乱，所以纠正缺氧时的糖代谢也是治疗脊髓损伤患者的重要步骤。能量缺乏会导致神经元凋亡比率增加，这可能与抗凋亡的元素在能量缺乏时功能障碍有关[69]。所以，对于能量代谢的研究就显得尤为重要。葡萄糖转运体在能量产生方面发挥至关重要的作用，在哺乳动物中，目前发现的葡萄糖转运体亚基共有14种，其中，GLUT1和GLUT3是中枢神经系统能量代谢中最重要的2种[70]，前者的功能主要使葡萄糖通过血脑屏障的内皮细胞进入脑组织[71]，而后者主要使葡萄糖通过神经元细胞膜[72]，二者相辅相成，共同维持神经系统内能量代谢的稳定。有研究发现，当葡萄糖转运体的功能被抑制时，神经系统则表现出明显的功能紊乱和神经元异常死亡[73]，当机体受到创伤时，GLUT1和GLUT3表达明显增多，这说明机体内存在调节GLUT的因子。在缺氧情况下，HIF-1增多，继之GLUT3表达量明显升高，说明GLUT1和GLUT3可能是HIF-1的下游因子[69]。目前可以肯定的是HIF-1可以通过PI3K/Akt/mTOR途径诱导GLUT表达增多[74]，以满足中枢神经系统需要的能量供应及维持神经元结构和功能的相对完整，这对于改善脊髓损伤患者的能量代谢至关重要。

2.3.3 EPO促红细胞生成素(Erythropoietin, EPO)是红细胞生成所必需的，它在胚胎期和胎儿期主要在肝脏生成，成年后主要在肾脏产生[75]。EPO主要受到局部组织氧合状况的调节，当组织氧合差时，HIF刺激EPO生成增多，释放入血，血液循环中的EPO随后与骨髓红系祖细胞上的EPO受体结合，促进红细胞生成增多，组织氧合得到改善；反之，则使红细胞生成减少，整个调节过程是经典的负反馈回路调节[76]。但如果EPO调节的红细胞稳态不能维持在生理水平，则可能会导致相应疾病的发生，如贫血或红细胞增多症，也会给机体带来不利影响[77]。EPO的调节几乎完全依赖HIF在mRNA水平上的调节，与HIF的含量密切相关[78]。EPOEPOR信号转导不仅具有促进红细胞生成的作用，而且与细胞保护作用相关[79];1)抗凋亡：其抗凋亡是通过抑制神经元中活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3实现的[80]，有活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3是一种半胱氨酸蛋白酶,它在参与凋亡的级联反应中起重要作用[81]；2)抗氧化：EPO还可以通过激活活性氧中和酶(包括超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶等)来增强抗氧化能力[82]；3)抗炎症反应：其抗炎症反应主要通过降低环氧合酶2和诱导型一氧化氮合酶生成起作用，另外其抑制小胶质细胞活化及抑制自噬激活也具有部分抗炎症反应作用[83,84]。

VEGF、GLUT和EPO在受到HIF-1的激活后分别在促进血管生成改善血运、改善糖代谢和促进氧合三个方面起到了保护脊髓的作用，同时可以对抗继发性脊髓损伤的相应过程如炎症反应、氧化应激及凋亡等发挥正性调节作用。因此，在脊髓损伤后使用HIF-1激动剂可能是对抗损伤、改善预后的一种重要途径。

3 小结

目前，HIF-1因为其有效的诱导下游基因表达的特点已成为治疗脊髓损伤的重要靶点，且日益成熟的神经干细胞移植技术也为治疗脊髓损伤带来了曙光，将HIF-1基因转染的神经干细胞植入患者体内俨然成为未来治疗该病的重要方向。脊髓损伤尤其是继发性损伤的发病机制复杂，各种因素交互作用，互不分割，在脊髓损伤发生后成为共同决定其疾病状态的关键因素，所以对于其发病机制，还需要进一步深入的研究，以期为神经干细胞移植提供利于生长的微环境，继而提高干细胞移植成功率，减少并发症的发生及改善患者预后及生活质量。

4 研究展望

近年来，低氧诱导产生的HIF-1在促进脊髓损伤后神经功能恢复中的作用逐渐得到广泛关注和认同，HIF-1对于脊髓损伤后神经功能恢复具有重要价值。但相关研究暂时还不能完全解释其神经保护作用的机制，且脊髓损伤机制复杂。所以，还需要大量实验研究从相关通路切入，为脊髓损伤的临床治疗带来有力的证据支持。