氧化应激在心肌缺血再灌注损伤中的研究进展

李思源，刘振兵

1 内蒙古医科大学，呼和浩特010100；2 内蒙古医科大学鄂尔多斯临床医学院 鄂尔多斯市中心医院

在全球范围内，急性心肌梗死的发病率和病死率居高不下，随着治疗技术的不断进步，再灌注治疗使得急性心肌梗死患者的病死率明显下降。但再灌注后发生的氧化应激（OS）会诱发心肌缺血再灌注损伤（MIRI）进而导致细胞死亡［1］。MIRI 在临床与基础实验转换中仍存在许多问题［2］。探讨OS 在MIRI 中的发生及作用机制，可为MIRI 的治疗和开发相关药物提供参考及思路。现将近年OS 在MIRI中的研究进展综述如下。

1 OS在MIRI中的作用

正常生理情况下，体内各种氧化剂和抗氧化防御系统之间存在相互作用，使得体内氧化剂与抗氧化防御系统处于动态平衡中，心肌缺血再灌注过程中氧化剂产生过多导致其与抗氧化防御系统的动态平衡被打破，从而造成氧化剂和抗氧化防御系统的不平衡，称为 OS［3］，其主要是 ROS 形成与酶和非酶抗氧化剂之间不平衡的结果。OS 是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。OS 通常与细胞和亚细胞水平中ROS 或活性氮（RNS）含量升高有关，他们在MIRI过程中起重要作用，其中ROS 作用更加广泛。ROS是一组短寿命的低相对分子质量化合物，是由氧经历的各种反应衍生而来，ROS包括超氧阴离子（O2·-）、羟基自由基（·OH）、过氧化氢（H2O2）、单态氧（O-）和次氯酸（HClO）［4］。ROS 被认为是细胞代谢、增殖、分化、免疫系统调节和凋亡的重要介质，生理状态下，ROS维持在较低水平作为信号分子发挥作用。在病理生理条件下，ROS的主要来源包括MIRI过程中的线粒体呼吸电子传递链、黄嘌呤氧化酶（XO）、NADPH 氧化酶系统、解偶联的一氧化氮合酶（NOS）系统与其他酶原系统［5］。

2 MIRI中ROS的产生途径

2.1 线粒体途径 在MIRI 中OS 反应主要由ROS介导，线粒体是ROS 的主要来源，而线粒体中呼吸链复合体Ⅰ和Ⅲ是构成线粒体来源ROS 的重要部分之一［6］。线粒体负责细胞能量的产生，当线粒体进行氧化磷酸化被干扰时，会导致ROS 生成速率增强，这一过程不仅减少了细胞能量生成（减少ATP的产生），而且导致ROS的产生倾向增大［7］。当线粒体感知到细胞内的OS会启动应激信号的释放，导致膜去极化、腺嘌呤核苷酸水平改变、ROS 产生、Ca2+超载和mPTP 开放。但在正常生理状态下线粒体中存在多种抗氧化机制来抵消ROS 的作用，从而减少其对细胞的损伤。当缺血器官血液供应重新恢复时，氧气大量涌入会加剧ROS 的产生，影响线粒体中呼吸链的正常运作，并破坏膜成分中的DNA、蛋白质和脂质，最终导致线粒体功能障碍，引起细胞和组织的功能障碍进而导致细胞死亡［8］。

2.2 NADPH 氧化酶（NOX）途径 NOX 是能调节ROS 产生的特殊功能酶，NOX 所产生的ROS 起第二信使的作用，参与调节细胞分化、增殖和凋亡，其中NADPH 氧化酶 2（Nox2）和 NADPH 氧化酶 4（Nox4）亚型在调节心肌细胞的发育中起重要作用。再灌注期间，当O2重新灌注到缺血部位，会引起NOX的上调和激活，进而产生ROS［9］。ROS可通过介导中性粒细胞的浸润，进一步使NOX活化促使ROS的产生。

2.3 髓过氧化物酶（MPO）途径 MPO 是一种中性粒细胞和单核细胞酶，通过产生次氯酸、自由基和RNS 来增强H2O2的反应性。 髓过氧化物酶在中性粒细胞呼吸爆发时，需血红素作为辅助因子并从H2O2和氯离子的反应中产生次氯酸。一氧化氮与氧或氧相关的反应中间体（如超氧化物）相互作用能产生大量的 ROS和 RNS［10］。

2.4 其他产生途径 在局部缺血期间，ATP被逐步分解为次黄嘌呤，次黄嘌呤在组织中积累，黄嘌呤脱氢酶通过蛋白水解机制转化为黄嘌呤氧化酶，缺血组织中存在过量的必需底物次黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶，但由于缺乏为反应提供燃料的氧分子，次黄嘌呤氧化为黄嘌呤和尿酸的反应无法进行。再灌注时，该必需的底物突然重新提供给组织，从而加剧ROS的快速过量产生。缺血再灌注过程中，细胞内H+、Ca2+的积累及线粒体膜电位的破坏亦导致ROS 的形成［11］。研究表明，残留 O2的存在是缺血期间 ROS 生成的关键因素，由于电子漏出增多，线粒体电子传递链受损被认为有助于残留O2向O2·-转化。

3 MIRI过程中氧化应激介导损伤的途径

3.1 ROS 介导途径 OS 是再灌注损伤的重要标志，其通过产生ROS 诱导细胞损伤，甚至死亡。及时的再灌注对于减轻缺血性损伤和挽救可存活的心肌至关重要，但其可促进心肌细胞的损伤。尽管ROS在缺血再灌注（I/R）中的确切作用仍不明确，但在I/R 细胞损伤的起始过程中得到认可。过量的ROS在MIRI损伤中起重要作用，积累的ROS除激活应激反应的通路外，与膜磷脂脂肪酸反应，会直接破坏细胞膜磷脂双分子层，导致膜各组分比例失常，影响膜流动性、细胞器、膜通透性、离子通道、膜结合酶等的生理功能，引起细胞不可逆损伤，并且脂质过氧化会引起线粒体和肌膜的不稳定使非特异性小分子进入膜内，导致线粒体基质肿胀和凋亡；还可导致蛋白质变性，并直接对DNA 造成损伤，特别是线粒体DNA，通过破坏核酸的核糖，干扰其复制，影响蛋白质正确合成，导致细胞死亡；甚至还能降解位于细胞间隙中的成分，通过增加细胞膜的通透性，导致组织水肿，继而影响物质的转运、信号传递等功能［12］。这种非特异性损伤启动细胞因子介导的级联反应，导致肿瘤坏死因子α（TNF-α）的产生。过量的TNF-α表达和随后的心肌细胞肿瘤坏死因子α1型受体刺激会导致收缩功能障碍、肥大、纤维化和细胞死亡［13］。

OS的严重后果之一还有mPTP的开放，mPTP主要维持线粒体膜电位及细胞内外的离子平衡，通常不被离子和蛋白质渗透，对于维持线粒体的结构和功能有重要作用。虽然短暂的mPTP 开放参与心脏保护，但长期开放会导致细胞生物学中不可逆转的变化和细胞死亡，这是由于促凋亡因子的释放所致。缺血期间细胞的酸性环境会阻止mPTP 的开放和心肌细胞过度收缩，再灌注期间ROS 通过诱导mPTP 的开放，使线粒体肿胀、破裂并导致促凋亡因子释放从而启动细胞死亡信号传导通路，ROS 还可诱导产生更多ROS进一步加剧损伤［9］。

线粒体作为ROS 产生的主要场所，在氧化应激反应中有多种途径产生ROS 进而促进氧化损伤，如硫氧还蛋白互作蛋白（TXNIP）从细胞核穿梭到线粒体，硫氧还蛋白2（Trx2）在线粒体中调节线粒体ROS的产生和线粒体凋亡信号通路。Trx2通过减少半胱氨酸氧化形成的二硫键来修复可逆的氧化蛋白损伤，硫氧还蛋白通过二硫键与Trx2 结合，抑制Trx2的还原功能。TXNIP与Trx2的相互作用促进线粒体ROS 的产生，触发线粒体凋亡信号通路，导致I/R 损伤。OS 会损害细胞器，如内质网和线粒体，从而促进Ca2+离子和促凋亡蛋白释放到细胞质中，从而增强细胞凋亡途径。硫氧还蛋白互作蛋白介导这些生物过程，并通过其促氧化作用促进组织的氧化损伤。

3.2 NO 途径 在心肌缺血再灌注过程中，OS 过程存在不同途径介导的氧化损伤，如超氧化物与一氧化氮（NO）快速反应形成具有高度反应性的中间体过氧亚硝酸盐（ONOO-）。随着细胞内酸化的增加，ONOO-变得更加质子化，形成过氧亚硝酸（ONOOH），然后迅速转化为二氧化氮（NO2）和·OH。ONOO-/ONOOH 成为强细胞毒性氧化剂，引起氧化损伤。过量的NO 还可通过多种途径激活线粒体凋亡，从而诱导OS［14］。

4 MIRI中氧化应激与其他途径的相互作用

4.1 氧化应激触发促炎反应 ROS 不仅通过自身造成MIRI，还可通过促进其他途径引起MIRI。当细胞暴露于高水平的ROS 时会触发炎症级联反应和黏附分子的表达，如通过使核因子κB（NF-κB）激活，触发促炎反应，其特征是TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-8 水平升高，黏附分子（如VCAM-1 和ICAM-1）的表达增加，从而促进OS［15］。炎症级联反应的发生和黏附分子的表达会导致白细胞（特别是嗜中性粒细胞）堵塞心脏毛细血管并使得毛细血管内皮肿胀，从而阻碍毛细血管内血液流动，这对血管运作起负性作用［19］。在炎症级联反应触发后，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）被炎症介质激活，使iNOS 解偶联成为引起心肌OS的主要贡献者。

4.2 氧化应激引发细胞凋亡 ROS 水平增加可使金属蛋白酶和钙蛋白酶的激活，有助于细胞膨胀和溶解。可使mPTP 开放且会导致线粒体肿胀和线粒体外膜破裂，从而有利于促凋亡因子的沉积和SMAC/Diablo从膜间间隙进入细胞质，进而引发细胞凋亡［16］。线粒体诱发的细胞凋亡受Bcl-2家族蛋白的调控，位于线粒体外膜中，Bcl-2家族蛋白控制线粒体膜的通透性，然后调节细胞色素C（Cyt c）的释放。他们可在功能上分为促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白。前者包括Bad、Bax、Bak、Bid、Bim、Puma 和BNIP3；而后者包含 Bcl-2、Bcl-x、Bcl-xL 和 BAG。在 Bcl-2 家族蛋白中，Bax 可在细胞核或线粒体（np53 或mp53）中被抑癌蛋白 p53 上调；而 Bcl-2 或 Bcl-xL 可阻断 np53 或mp53介导的细胞凋亡，当p53的表达受到抑制时，心脏组织中的Bax和Caspase-3被下调［17］。Cyt c是一种信号分子，在细胞应激过程中从线粒体释放到胞质中。在胞质中，Cyt c 可结合并激活Apaf-1和proCaspase-9，随后导致Caspase-9激活，进而促进Caspase-3和Caspase-7的激活［18］。

4.3 氧化应激诱导钙超载 OS 不仅可损伤线粒体，还可损伤内质网，从而促进Ca2+和促凋亡蛋白释放至细胞质中，增强凋亡途径。OS可能在诱导细胞内Ca2+超载中发挥关键作用，过量ROS 触发的线粒体OS 会加速线粒体功能失常，降低线粒体能量供应，破坏钙稳态，导致线粒体钙超载［19］。ROS可通过影响兴奋—收缩耦合的核心蛋白，包括L-型钙通道、钠通道、钾通道和钠—钙离子交换器，直接损害心肌细胞的电生理和收缩机制。 ROS 还可改变肌浆网Ca2+-SERCA 的活性，并降低肌丝钙的敏感性。此外，ROS 通过影响参与能量代谢的蛋白质的功能而导致能量不足。MIRI 导致ROS 的积累从而引起OS，对心肌造成不利影响：①ROS 增加严重影响心肌细胞的电生理。ROS 逆转Na+/Ca2+交换器（NCX）的功能，导致Ca2+流入和Na+流出。ROS 还通过L-型钙通道增加Ca2+的内流。②过量的ROS 促进RyR2活性，抑制肌浆网Ca2+-SERCA2 活性，导致钙超载，降低肌丝钙敏感性，最终导致收缩功能障碍［20］。

5 MIRI中减轻OS相关的机制及通路

在生理条件下，细胞具有抗氧化防御系统，以防止ROS 造成损伤。通过抗氧化剂发挥作用的机制很多，如：①清除活性氧或其前体；②抑制ROS 的形成；③通过与金属离子的结合减弱ROS 生成的催化作用；④增强内源性抗氧化生成；⑤通过上调抗凋亡基因Bcl-2 减少细胞凋亡。当组织处于缺血缺氧状态时，氧自由基清除系统的功能会降低或消失，而其产生会增加［21］，因此可减轻OS。谷胱甘肽（GSH）是心脏中ROS 最重要的清除剂，谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）可催化谷胱甘肽生成氧化谷胱甘肽（GSSG），将H2O2还原为H2O 或脂质过氧化氢（ROOH）进而生成稳定的醇。谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）与谷胱甘肽还原酶（GSSG-R）一起维持低的GSH水平，保护细胞免受过氧化物损伤［22］。超氧化物歧化酶（SOD）亦是清除ROS 的重要物质，可将O2·-催化成细胞毒性较低的H2O2，最后被CAT 或GPx 系统转化为水和氧分子，其他清除剂还包括硫氧还蛋白、维生素C、维生素E 等，通过他们的共同作用将ROS 浓度严格控制在较低的稳态水平［7］。但抗氧化剂在参与心脏病理生理过程中并不能识别特定来源的ROS，当氧化剂浓度超过细胞的适应能力时，细胞会经历更严重的OS。线粒体在OS 过程中发挥重要作用，其中AMPK/SIRT1/PGC-1α 信号通路作为线粒体中充当能量传导作用的通路，在线粒体生物合成、能量代谢和OS 中起重要的调节作用。Tilianin 可通过调节AMPK/SIRT1/PGC-1α 信号通路来改善线粒体能量代谢并减轻 OS，从而保护心肌 IRI 中的线粒体［23］。研究表明，ANG Ⅱ通过核AT1Rs 促进AT2R 信号级联，包括线粒体AT2Rs 和Mas 受体的保护机制。核ANG Ⅱ受体的刺激通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ 辅激活子1α 的抗氧化活性增强线粒体生物活动发生，并增加去乙酰化酶活性，从而保护细胞免受 OS［24］。减轻 OS 的机制：增强 eNOS 介导的 Keap1的亚硝基化，进而上调核Nrf2 和与Nrf2 相关的抗氧化信号通路，从而减轻 OS［25］；通过 cGMP-PKGI 的活化抑制 OS［26］；PI3K/Akt 信号的激活参与心脏 I/R 的保护，而OS 能通过影响PI3K/Akt 信号通路从而造成损害［27］。γ-谷氨酰转肽酶（GGT）是一种异二聚体膜结合酶，通过水解和/或转肽作用破坏γ-谷氨酰胺键，在细胞外还原型谷胱甘肽及其S-共轭物的代谢中发挥生理作用。GGT 抑制剂通过抑制GGT 活性和随后的ROS 产生，对I/R 引起的心脏功能障碍发挥保护作用［28］。

综上所述，OS 在MIRI 过程中起重要作用，其中ROS与OS密不可分。正常生理状态下，抗氧化系统会将ROS 控制在较低水平，当组织缺血缺氧后，伴随抗氧化系统功能的降低或消失，ROS产生增加，使得ROS 对细胞造成损伤。线粒体是产生ROS 的主要来源之一，ROS 通过直接对蛋白质、DNA、脂质造成损伤，并损伤线粒体、内质网等细胞器，进而促进细胞凋亡。ROS 还可通过促进炎症级联反应、炎性因子、促凋亡因子等释放加强MIRI。