洞庭湖流域沅江蚬属贝类的倍性研究

裴宏谦,占江凡,秦 玲,李科静,皮 杰,曾 聪*,李德亮*

(1.湖南农业大学动物科学技术学院,中国湖南 长沙 410128;2.湖南应用技术学院农林科技学院,中国湖南 常德 415000)

蚬属(Corbicula)贝类隶属于软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(Lamellibranchia)、帘蛤目(Venaroida)、蚬科(Corbiculidae),原产于亚洲、非洲、澳洲和中东地区[1～2]。1924年首次在北美洲太平洋沿岸被发现[3～4]后,蚬迅速在北美、南美和欧洲大陆扩散,目前已经成为世界各地咸淡水水域的优势种群,且对当地经济和生态均造成严重威胁[5～7]。尽管如此,形态的高度可塑性和生殖方式的多样性,导致蚬属的分类尚未准确厘定[8～11]。蚬因其丰富的营养与药用价值,一直深受我国东南沿海、日本和韩国民众的喜爱,是重要的渔业资源[12～13]。近年来,受过度捕捞及生境破坏等因素的影响,我国蚬属贝类资源日益衰退,亟待加强保护[14～15]。

研究表明,蚬具有二倍体、三倍体及四倍体3种倍性[16～19],且不同倍性蚬的分布具有明显区域性,入侵地的蚬均为三倍体[20],而原产地水域则多种倍性的蚬均有分布,但四倍体蚬目前仅在我国四川省安岳县的溪流中有报道[21]。蚬存在雌雄同体和雌雄异体两套性别系统,其中雌雄同体和雌雄异体的蚬在原产地共存[22],而入侵地的蚬则均为雌雄同体[23～24]。染色体核型分析是倍性鉴定最传统和经典的方法,随着技术的发展,基于DNA含量的显微荧光法和流式细胞术也逐渐应用于动物倍性的鉴定[25～26]。黄勤[27]利用核型分析法鉴定福建闽江地区的河蚬(Corbicula fluminea)为二倍体;Qiu等[21]同时采用核型分析及显微荧光法,证实四川安岳县的溪流中共存有三倍体及四倍体河蚬。流式细胞术是在显微荧光法基础上发展起来的一种细胞学分析方法,其可将4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染液与DNA特异性结合形成的特征荧光信号转化为相应的DNA 含量值[28～29]。该方法已被用于鲍[30]、牡蛎[31]等多种软体双壳类的倍性分析,但尚未见其在蚬属贝类倍性鉴定中的应用报道。

作为长江流域仅存的两大通江湖泊之一,洞庭湖蚬资源丰富[32],但尚未见其倍性报道。本文以洞庭湖支流——沅江常德鼎城区江段的蚬属贝类为研究对象,在传统染色体核型分析的基础上,采用流式细胞术对其倍性进行鉴定,并探讨其倍性与形态、性别的关系,以期为其种质资源评价和管理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2019年7月,利用手操网于沅江常德鼎城区江段(111.693°E,28.987°N)采集蚬样品。采集的样品被带回实验室,置于曝气水中暂养。

1.2 形态测量

将样品置于吸水纸上吸干表面水分,用游标卡尺测量样品壳长(shell length,SL)、壳宽(shell width,SW)及壳高(shell height,SH),用分析天平测量其湿重(wet weight,W)。

1.3 倍性鉴定

1.3.1 核型分析法

随机选取性成熟个体,称重后按4 μg/g湿重的剂量标准,向活体斧足注射质量浓度为5 mg/mL的植物血凝素(phytohemagglutinin,PHA),处理24～25 h;同样部位再以2 μg/g湿重剂量注射质量浓度为10 mg/mL的秋水仙素,处理4～5 h。处理结束后,用剪刀撬开蚬壳,剪取鳃组织并剪碎,加1～2mL生理盐水稀释,在上清液中加入0.037 5 mol/L的KCl溶液,低渗处理30 min,再以2 500 r/min离心5 min,去除上清液后用卡诺式固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)固定鳃细胞30 min,以3 000 r/min离心5 min,去除上清液,重复固定两次;热滴片,10%Giemsa染液染色30 min,流水清洗玻片,风干后显微观察[33]。

1.3.2 流式细胞术

随机选取蚬样品,解剖并剪取闭壳肌组织,置于少量磷酸缓冲盐溶液(pH 7.2～7.4)中用剪刀剪碎,过滤得到体细胞悬液,加入DAPI荧光染液;分别以二倍体太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)及二倍体泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)为参照,采用CyFlow®Space流式细胞仪(德国Partec公司生产)测定体细胞的相对 DNA 含量[34～36]。

1.4 性别鉴定

参照文献[15]的方法,先剪取新鲜样品的性腺组织,随后采用Bouin’s组织固定液将其固定,固定的组织经乙醇脱水、二甲苯透明等操作后制成石蜡切片,用苏木精-伊红染液染色后封片,最后将切片样品置于奥林巴斯显微镜下镜检并确定其性别。

1.5 数据分析处理

2 结果

2.1 倍性特征

此次分析的45个样品中存在二倍体30个,三倍体15个。传统的核型分析结果显示:二倍体蚬的体细胞染色体数目为2n=36(图1A),包括1对中部着丝粒染色体(metacentric,M)、1对亚中部着丝粒染色体(submetacentric,SM)以及16对近端着丝粒染色体(subtelocentric,ST)(图1C);三倍体蚬的体细胞染色体数目为3n=54(图1B),包括1对M染色体、5对SM染色体和12对ST染色体(图1D)。

以二倍体太平洋牡蛎为参照,流式细胞仪所测二倍体蚬和三倍体蚬的DNA相对含量分别为12 921.82±217.43(图 2A)和 19 041.39±375.31(图2B)。以二倍体泥鳅为参照,流式细胞仪所测二倍体蚬和三倍体蚬的DNA相对含量分别为777.77±32.24(图 2C)和 1 137.71±38.02(图 2D)。

图1 沅江蚬体细胞的染色体分裂相及核型(A)二倍体蚬的染色体分裂相;(B)三倍体蚬的染色体分裂相;(C)二倍体蚬的核型;(D)三倍体蚬的核型。Fig.1 Chromosome division and karyotype in somatic cells of Corbicula clams from the Yuan River(A)Chromosome division of diploid Corbicula clams;(B)Chromosome division of triploid Corbicula clams;(C)Karyotype of diploid Corbicula clams;(D)Karyotype of triploid Corbicula clams.

2.2 形态特征

45个蚬的湿重、壳长、壳宽和壳高分别为(5.42±1.63)g、(24.73±2.87)mm、(15.68±1.39)mm、(23.47±2.56)mm(表1)。单因素方差分析显示,两种倍性蚬的湿重、壳长、壳宽和壳高均无显著性差异(P＞0.05),但二倍体蚬的SW/SL比值显著大于三倍体(P＜0.05)。

图2 流式细胞仪检测的沅江蚬体细胞的相对DNA含量(A～B)以二倍体太平洋牡蛎为参照;(C～D)以二倍体泥鳅为参照。Fig.2 Relative DNA contents in somatic cells of Corbicula clams from the Yuan River detected by flow cytometry(A～B)Diploid Crassostrea gigas was used as reference;(C～D)Diploid Misgurnus anguillicaudatus was used as reference.

2.3 性别特征

45个蚬中有雌雄同体23个、雄性13个、雌性9个(图3)。在30个二倍体蚬中,雌雄同体、雄性和雌性的个体数量分别为16、7、7;在15个三倍体中,雌雄同体、雄性和雌性的个体数量分别为 7、6、2(图 4)。

表1 沅江不同倍性蚬的湿重和形态特征Table 1 Comparisons of wet weight and morphological characteristics of Corbicula clams with different ploidies from the Yuan River

3 讨论

3.1 蚬的倍性特征

本研究首次采用流式细胞术对沅江蚬的倍性进行分析。与传统核型分析方法相比,利用流式细胞术鉴定蚬的倍性,极大地降低了实验人员对细胞生物学分析技术的依赖,简化了倍性鉴定流程,提高了鉴定效率。研究表明,蚬属贝类具有二倍体、三倍体、四倍体3种倍性,且不同倍性蚬的分布具有明显区域性。通常,入侵地蚬均为三倍体,而原产地水域的蚬则是二倍体、三倍体及四倍体均有分布[20,22]。在我国,福建闽江河蚬为二倍体[27],台湾基隆河河蚬为二倍体和三倍体[17],四川安岳县溪流中的河蚬为三倍体和四倍体[21]。本研究采用传统核型分析法和流式细胞术均证实二倍体和三倍体的蚬共存于沅江常德鼎城区江段。其中,二倍体蚬的体细胞染色体有36条,三倍体有54条,但染色体的单倍体数均为n=18(图1)。已有研究表明,蚬染色体的单倍体数存在n=18或n=19两种类型,其中n=19的蚬多分布于海水水域,且以二倍体为主[18];n=18的蚬则分布于淡水水域,且为多倍体[19]。这种染色体数目的变化或许是蚬属贝类空间入侵演化的结果,即蚬在从海水到淡水的入侵演化过程中[37～38],1号和2号染色体逐渐融合[20],使单倍体数逐渐由n=19演化为n=18[27]。

图3 沅江蚬的性腺组织切片(A～B)雄性;(C)雌性;(D)雌雄同体。Fig.3 Gonad tissue sections of Corbicula clams from the Yuan River(A～B)Male;(C)Female;(D)Hermaphrodite.

图4 沅江不同倍性蚬的性别比例Fig.4 Sex ratio of Corbicula clams with different ploidies from the Yuan River

沅江二倍体蚬和三倍体蚬的核型公式分别为2n=36=2M+2SM+32ST和3n=54=3M+15SM+36ST,两种核型中均仅有1对M染色体,且该染色体在形态上明显大于其他染色体,此结果与黄勤[27]、Papk等[39]的研究结果相似。此外,二倍体蚬的SM染色体和ST染色体分别为1对和16对,而三倍体蚬则分别为5对和12对。福建闽江二倍体河蚬的M染色体、SM染色体和ST染色体分别为1对、13对和4对;四川安岳县三倍体河蚬的上述染色体分别为2对、13对和3对,两者均含有较多的SM染色体,而ST染色体相对较少。对比以上数据可知,沅江蚬的ST染色体数量高于福建闽江与四川安岳两地的河蚬。有研究显示,动物在进化过程中,体细胞核型将由含较多ST染色体逐渐向以M和SM染色体为主进行演化[40～41],因此推测沅江蚬较福建闽江和四川安岳县溪流中的河蚬更为原始。

3.2 蚬的倍性与形态

动物的三倍体较其二倍体多一套染色体,且其个体一般较二倍体大,如三倍体太平洋牡蛎较二倍体表现出明显的生长优势[42]。但本研究中的三倍体蚬较二倍体并无显著的生长优势,表现为不同倍性蚬的SL、SW、SH均无显著差异,仅SW/SL的比值存在显著差异(P＜0.05)(表1)。此外,大量研究显示不同壳色蚬的外壳形态之间差异不显著。Qiu等[21]利用壳色特征对蚬的倍性进行比较分析,发现黄壳河蚬均为三倍体,而棕壳河蚬均为四倍体,且两种壳色蚬的SL、SW和SH没有显著差异,仅三倍体蚬的SW/SL和SW/SH比值显著大于四倍体。Wang等[11]研究报道,大通湖白色和紫色壳蚬的SL、SW和SH也均无显著差异。虽然本研究显示二倍体蚬的SW/SL比值显著大于三倍体蚬,但是否可利用该比值简便地判断沅江蚬的倍性还需要进一步的验证。尽管如此,洪泽湖棕壳河蚬的SL、SW、SH及湿重均大于黄壳河蚬,而SL/SH比值则小于黄壳群体[43]。相关研究对香港新界河蚬的4种等位酶(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、磷酸葡萄糖异构酶和磷酸葡萄糖变位酶1/2)进行分析,结果显示白壳和紫壳河蚬的4个等位基因均没有显著差异,且遗传距离小[44～45]。Britton等[46]也认为,蚬壳的颜色和大小的多样性是环境作用的结果,而非遗传差异所致。但也有研究表明,即使在同样的环境条件下,蚬在壳色和形态特征方面也存在显著差异,由此认为形态差异为遗传因素所致,而非环境条件不同造成[17]。因此,蚬属贝类形态特征多样性的形成原因值得深入研究。

3.3 蚬的倍性与性别

已有研究表明,洞庭湖蚬存在雌雄异体和雌雄同体两种性别系统,且以雌雄同体为主,雌雄同体、雌性及雄性的个体比例约为16∶5∶4[47]。本研究结果显示,沅江蚬中雌雄同体的个体共占51.1%,其次为雄性个体,占28.9%,雌性个体占20.0%(图4),再次证实洞庭湖流域的蚬以雌雄同体为主,雌雄异体并存。相关研究报道,二倍体蚬均为雌雄异体,而多倍体蚬均为雌雄同体[48～49]。比如:中国福建闽江的二倍体河蚬[27]、日本琵琶湖的二倍体蚬C.sandai[50]、韩国二倍体蚬C.japonica[18]均为雌雄异体,入侵地蚬均为三倍体且雌雄同体[19],中国四川安岳县溪流中的三倍体和四倍体蚬C.fluminea也均为雌雄同体。但是,本研究结果显示沅江蚬的倍性与性别之间没有显著的相关性,即二倍体蚬中雌雄同体共占53.4%,雄性与雌性各占23.3%;三倍体蚬中雌雄同体占46.7%,雄性占40.0%,雌性仅占13.3%。Okamoto等[50]认为蚬在从沿海到内陆的入侵演化过程中,染色体的单倍体数目减少,由n=19演化为n=18,但倍性逐渐多倍化,且性别也由雌雄异体逐步向雌雄同体为主演化[51]。因此,有必要从大尺度上分析盐度等环境因子对蚬属贝类倍性和性别特征的影响,从而全面解析蚬属贝类倍性和生殖特征的空间演化机制。