注射型富血小板纤维蛋白联合BMSCs在坐骨神经损伤的实验研究

叶 放 王彦生 于 宁 许 蕙

沈阳医学院附属中心医院手外5 科，辽宁沈阳 110000

外周神经损伤后其后续影响及功能恢复的病理生理过程十分复杂，神经组织的修复过程相对缓慢、再生生理较差[1]，而且损伤后发生局部粘连、组织萎缩和运动终板退化可能性较大，进而导致神经功能的损伤修复受到影响，是目前显微外科重点与难点问题[2]。干细胞移植作为当今显微外科神经修复治疗的新型手段，骨髓间充质干细胞（BMSCs）是目前较为实用的种子细胞，尤其在外周神经损伤修复过程中发挥重要作用[3]。虽然其临床应用较为广泛，但其仍存有一定不足，如体外培养归巢率低，移植后细胞存活能力欠佳等[4]。注射用富血小板纤维蛋白具有较高的促生长因子释放率，从而更有效地诱导BMSCs 的生产与分化[5]。为更好地提高外周神经损伤的修复治疗效果，本研究通过对大鼠应用自体注射型富血小板纤维蛋白联合BMSCs 进行治疗，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

DMEM 培养基由美国HyClone 公司提供（生产批号：20180201），十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）配胶试剂盒由上海碧云天生物科技公司提供（生产批号：201811058），CKX41型倒置相差显微镜由日本奥林巴斯公司提供，7000型透射电镜由日本东芝公司提供。

1.2 研究对象

选择10日龄SD 乳鼠6只，雌雄各半，体重为25～35 g；另外选择2月龄SD 大鼠24只，雌雄各半，体重195～225 g；均购自沈阳医学院实验动物中心（合格证号：20191105）。本研究造模及入组动物选择均通过实验动物伦理委员会审核同意，SD 大鼠常温下适应性饲养1 周备用。

1.3 方法

1.3.1 大鼠BMSCs 及注射型富血小板纤维蛋白的制备 取6只乳鼠采用离颈法处死，采集由DMEM 培养基从双侧胫骨干骺端冲洗骨髓，离心管反复吹打制备细胞悬液，随后严格按照密度梯度离心法进行细胞分离、培养和传代，选择培养3 周后第4 代纯化BMSCs群备用。注射型富血小板纤维蛋白以改良低速离心法进行，具体通过SD 大鼠眼眶采血法采集自体血，置于低速离心管内离心3 min后获取浆液层与红细胞层中间的富血小板纤维蛋白层，所制备富血小板纤维蛋白无需抗凝，但要求在制备成功后15 min 内应用。

1.3.2 分组治疗 将24只2月龄SD 大鼠随机分为观察组与对照组，各12只，以改良挤压损伤法制作大鼠坐骨神经损伤模型，先注射3%戊巴比妥实施腹腔麻醉，随后双侧后肢脱毛，无菌条件下对实验侧坐骨神经止血钳上齿挤压45 s，将坐骨神经积压呈扁薄状即为模型制备成功。造模后，观察组与损伤部位局部注射BMSCs 悬液250 μl 及自体富血小板纤维蛋白250 μl，对照组局部注射生理盐水500 μl，治疗14 d后进行相关结果分析。

1.3.3 观察指标 比较治疗前后两组坐骨神经功能指数变化情况；分析两组治疗14 d后大鼠坐骨神经轴突透射电镜图像结果；统计两组治疗14 d后腓肠肌湿质量变化情况。坐骨神经功能指数为监测神经损伤后恢复情况的一种无创检测手段，以训练小鼠沿限定轨迹走动，并通过后爪不同颜色无毒染料印迹为标准，记录治疗前及治疗14 d后两组实验大鼠沿轨迹行走指标，结合爪长度、脚趾展开长度等综合计算，计算公式选择Bain 公式进行，具体为SFI=109.5（ETSNTS）/NTS-38.3（EPL-NPL）/NPL+13.3（EIT-NIT）/NIT-8.8（N：正常足；E：伤侧足；PL：足印长度；TS：足趾宽度；IT：中间足趾宽度；）,其中SFI=0 为正常，SFI=-100为完全损伤；腓肠肌湿质量指标包括：健侧与实验侧腓肠肌湿质量数据，并计算腓肠肌湿质量恢复率，通过十万分之一精度电子天平秤测定治疗14 d后双侧腓肠肌湿质量，腓肠肌湿质量恢复率=实验侧（g）/正常侧（g）×100%。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较使用独立样本t 检验，组内比较使用配对t 检验，组间率的比较采用χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组治疗前后坐骨神经功能指数变化的比较

治疗前两组坐骨神经功能指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05），治疗后两组坐骨神经功能指数低于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05）；且治疗后观察组坐骨神经功能指数低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 两组治疗前后坐骨神经功能指数变化的比较（±s）

表1 两组治疗前后坐骨神经功能指数变化的比较（±s）

组别只数 治疗前 治疗后 t 值 P 值观察组对照组t 值P 值12 12 85.6±13.2 85.5±13.3 0.018 0.985 5.9±0.3 29.3±1.9 42.141 0.000 20.910 14.491 0.000 0.000

2.2 两组治疗14 d后大鼠坐骨神经轴突透射电镜图像

两组大鼠坐骨神经透射电镜提示有髓鞘轴突比例情况提示，治疗14 d后，大鼠坐骨神经透射电镜提示观察组髓鞘轴突比例高于对照组（图1~2）。

图1 对照组治疗14 d后大鼠坐骨神经轴突透射电镜图（400×）

图2 观察组治疗14 d后大鼠坐骨神经轴突透射电镜图（400×）

2.3 两组治疗14 d后腓肠肌湿质量变化情况的比较

治疗后两组健侧腓肠肌湿质量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后观察组实验侧腓肠肌湿质量高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗后观察组腓肠肌湿质量恢复率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 两组治疗14 d后腓肠肌湿质量变化情况的比较（±s）

表2 两组治疗14 d后腓肠肌湿质量变化情况的比较（±s）

腓肠肌湿质量（g）健侧 实验侧组别只数 腓肠肌湿质量恢复率（%）观察组对照组t 值P 值12 12 0.52±0.02 0.53±0.02 1.225 0.234 0.46±0.01 0.37±0.01 22.045 0.000 88.50±0.03 69.80±0.06 965.664 0.000

3 讨论

神经组织损伤后虽具有一定的组织重塑能力，但随着微环境的改变为出现不可逆性改变[6]，进而导致神经修复与再生能力被抑制，给目前临床上针对外周神经损伤的修复其仍属于治疗难点[7]。以往治疗上多以神经电刺激等进行治疗，虽具有一定效果[8]，但整体疗效有待提高。近年神经支架、种子细胞及神经营养因子等生物工程手段的临床应用，为神经组织修复带来巨大突破[9]。

针对外周神经损伤，本研究制备大鼠坐骨神经损伤模型，其中观察组使用自体注射型富血小板纤维蛋白联合BMSCs 进行治疗，结果显示，治疗前两组坐骨神经功能指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后观察组坐骨神经功能指数低于同组治疗前及对照组治疗后，差异有统计学意义（P＜0.05）。证明针对大鼠坐骨神经损伤模型，使用自体注射型富血小板纤维蛋白联合BMSCs 进行治疗，相对于注射生理盐水的对照组，能更好地促进坐骨神经功能指数的提高，促进坐骨神经功能的恢复。治疗14 d后，大鼠坐骨神经透射电镜提示观察组有髓鞘轴突比例高于对照组（P＜0.05），提示自体注射型富血小板纤维蛋白联合BMSCs在治疗大鼠坐骨神经损伤方面，促进损伤神经轴突再生具有重要意义。治疗14 d后，观察组腓肠肌湿质量高于对照组，且观察组腓肠肌湿质量恢复率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），进一步说明针对大鼠坐骨神经损伤模型，自体注射型富血小板纤维蛋白联合BMSCs 治疗对促进平滑肌细胞增殖、血管形成等具有重要价值。

BMSCs 是一种具有自我更新、多向分化和分泌功能的多能干细胞[10]，以旁分泌集落刺激因子、干细胞生长因子、内皮细胞生长因子等多种细胞因子进而调节机体炎症反应，达到促进细胞修复，组织形成的目的[11-12]。另外，本研究使用的自体富血小板纤维蛋白联合BMSCs在神经局部鞘内注射，更好地为神经修复提供充足营养，并在15 min 内注射，避免了凝胶状态[13]，加大组织流动性，提高了临床应用效果；而且通过其释放的碱性成纤维细胞生长因子，显著提高BMSCs增殖与分化能力，并促进神经细胞的黏附、迁移效应，提高细胞外基质蛋白水平，进而更好地诱导BMSCs 增殖与分化[14-16]，促进平滑肌细胞与血管的形成，确保神经组织血管的重塑与增殖，达到修复受损神经的目的[17-18]。

综上所述，针对坐骨神经损伤大鼠，使用自体注射型富血小板纤维蛋白联合BMSCs 进行治疗，能有效提高坐骨神经功能，促进神经修复，提高平滑肌与血管再生能力。