页岩气开采压裂液中非氧化型杀菌剂作用机理及潜在生态风险*

张雯宇 卢培利# 程 勇 丁阿强 周上博 张利兰 包 凯 毛媛媛 汪 军 李成龙

(1.重庆大学煤矿灾害动力学与控制国家重点实验室，重庆 400044；2.重庆大学环境与生态学院，重庆 400045；3.中石化重庆页岩气有限公司，重庆 408400；4.重庆市环境工程评估中心，重庆 401121；5.重庆市生态环境科学研究院，重庆 401147)

页岩气是一种赋存在低渗透性富含有机质页岩地层中的天然气。水力压裂技术的应用使美国率先实现页岩气规模化开发。我国页岩气资源居世界第一，并已在四川盆地实现规模化开发。水力压裂技术的关键之一是压裂液(由杀菌剂、交联剂、减阻剂、缓蚀剂、pH调节剂等复合配制而成的特异性流体)，压裂液中水占90.8%(质量分数，下同)、支撑剂占8.5%，其余0.7%为杀菌剂等化学添加剂[1]21。尽管占比低，但由于钻井数量大、单井压裂液消耗量大，化学添加剂的实际使用量非常巨大。在压裂液的化学添加剂中，用于抑制地层和管道设备中微生物生长的杀菌剂尤其值得关注，其是压裂返排水中高浓度溶解性有机碳的主要来源之一，且种类众多[2]。这些杀菌剂本身及其在环境中的转化、降解产物不仅对人类健康存在潜在毒性作用，也可能对压裂返排水的后续生物处理和回用产生不利影响。

在我国环境管理逐渐由污染控制转向风险防控的背景下，随着页岩气开发范围和规模的扩大，其快速开发潜存的生态环境影响，尤其是杀菌剂的生态风险引起了广泛关注[3-4]。然而，我国页岩气规模化开发历时短，有关生态环境影响的认识尚在积累之中。为此，本研究对页岩气开采水力压裂液中典型杀菌剂的使用概况、杀菌机理、典型环境特性、生态毒理效应、潜在生态风险等进行综述和分析，以期为我国页岩气开发使用杀菌剂的生态风险研究和防控管理提供基础资料。

1 压裂液中杀菌剂使用概况

页岩气开采压裂液中的杀菌剂可使有害微生物(如硫酸盐还原菌(SRB)、产酸菌(APB)等)数量降至较低水平，防止管道堵塞、设备腐蚀、气体减产等，杀菌剂种类繁多，其用法用量也有较大不同。通常，压裂液中的杀菌剂总质量浓度在500 mg/L以上[5]16，约占压裂液总质量的0.06%[1]21。压裂返排水回用于压裂液后将导致微生物耐受性增强，或微生物因长期暴露于含盐水而导致耐盐性提高，都会增加杀菌剂用量。由于目前压裂液配方的不透明性及检测方法的局限性给水力压裂过程的潜在生态风险分析带来极大挑战，较大的风险不确定性使得杀菌剂被认为是需优先考虑的页岩气相关有机化合物。

按抑制方式，压裂液中的杀菌剂包括氧化型和非氧化型。氧化型杀菌剂包括氯系列、溴系列、卤化海因、臭氧、过氧化氢等，可通过反应释放的自由基攻击细胞成分进行杀菌，也可直接氧化细菌细胞壁或穿透细胞膜通过氧化胞内的不饱和键来杀菌。氧化型杀菌剂由于高效、低价在20世纪70至90年代的石油行业应用广泛，但由于其持续时间短且存在腐蚀设备、与其他化学品生成副产物等风险而在压裂液配制中应用有限[6]。

水力压裂过程中使用的非氧化型杀菌剂以溶胞类和亲电子型为主[5]18。溶胞类杀菌剂可通过与细胞膜表面的阴离子官能团结合、对脂质双分子层进行扰动，使细胞渗透调节能力丧失至最终溶解，以阳离子季铵盐类化合物(QACs)为主要代表[7],[8]710。亲电子型杀菌剂因具有强活性的电子接收官能团(如C=O双键等)而易与富电子基团(如暴露在细菌细胞壁膜蛋白上的硫醇(—SH)和仲胺(—NH))发生反应，从而使细胞壁损伤和细胞质凝固。这类杀菌剂以有机醛类为主，如甲醛、丙烯醛、戊二醛等，其中戊二醛使用频率最高，在30%以上[9]10252。

非氧化型杀菌剂占压裂液杀菌剂使用量的72.5%[10]，其中溶胞类杀菌剂QACs持续时间较长，通常与亲电子型杀菌剂戊二醛联用，通过协同作用提高效率，以下主要对QACs及戊二醛的杀菌机理、典型环境特性、生态毒理效应进行概括和分析讨论。

2 QACs的杀菌机理、典型环境特性与生态毒理效应

具有杀菌活性的长链QACs主要包括苄基烷基二甲基铵化合物(BACs，烷基链长C12～C18)、二烷基二甲基铵盐(DADMACs，烷基链长C8～C18)、烷基三甲基铵盐(ATMACs，烷基链长C12～C18)等[11]356。QACs在井下被稀释、降解、转化为其他化合物，返排回地面后随时间推移，其质量浓度可由最初的mg/L级降至μg/L级[12]。OETJEN等[13]检测到美国某水力压裂井的压裂返排水中QACs为1 mg/L；ZHONG等[14]发现加拿大某平台压裂返排水中QACs由最初的25 mg/L左右降至0.5 mg/L以下。

2.1 QACs杀菌机理

阳离子型杀菌剂对微生物细胞的影响之一是改变其疏水性，并对脂质双分子层进行扰动[15]。长疏水性烷基链被认为是QACs的主要杀菌基团，它以细菌细胞膜为靶点，带正电荷的季氮与膜内酸性磷脂头部基团结合，使细胞表面疏水性变化；同时侧链疏水尾部交叉进入疏水膜核心靶点位置，最终导致细胞质泄漏和细胞裂解。QACs分子本身并不参与化学反应，仅在细菌细胞膜的脂质双分子层和表面起到“楔子”和“离子交换器”的作用，故其杀菌机理属于物理杀菌。

一般来说，QACs可针对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母和丝状真菌起抑制作用，最佳杀菌碳链长为C16、C14、C12[16]。低浓度QACs会占据膜表面上的阴离子位点，与细胞膜内酸性磷脂头部基团结合而降低双层膜的流动性，并在膜中形成亲水空隙，使细胞失去渗透调节能力，致使钾离子、质子等流出；中等浓度QACs会扰乱在膜上进行的呼吸、溶质传递、细胞壁的合成等作用；高浓度QACs会形成胶束聚集体，直接将疏水性的膜组分(脂质、磷脂等)溶解，破坏基本渗透梯度，最终导致胞内物质泄露和细胞溶解[8]708。部分QACs(如苯扎氯氨)还可借助其正电荷和两亲性来结合并破坏核糖体[17]。

2.2 QACs典型环境特性

目前QACs已经在各类环境中被检出，地表水和污水处理厂进出水中QACs质量浓度为几至上千μg/L[18-19]；污泥和沉积物中的QACs则为几百至上千mg/kg，远高于与其共存的多环芳烃、有机氯农药、多氯联苯等其他有机污染物[20-21]。

QACs的亨利定律常数较低，挥发性较弱，但辛醇-水分配系数和吸着系数较大，呈疏水性，降解半衰期较长，容易通过离子交换、离子对、疏水键的吸附作用，在带负电的污泥、土壤和沉积物中积聚。全球每年生产使用的QACs在70万t以上，其中约75%最终进入废水处理系统，部分经由活性污泥吸附和降解去除[22]。α-氧化是QACs生物降解的最主要途径，虽然脱去N—R+键后QACs毒性降低，利于后续降解，但实际降解速率受微生物体内单加氧酶、还原型辅酶活性的限制，且降解产物三甲基铵盐的积累会影响生物活性和去甲基化速率进而影响转化过程[23]。普遍认为QACs的降解速率与烷基链长度负相关，在15 mg/L的起始质量浓度下，十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵的生物降解率分别为52.4%、13.6%、8.3%[24]。QACs较差的生物可利用性与其自身化学结构、环境浓度、与阴离子表面活性剂络合程度、溶解氧浓度和微生物类型/活性等因素有关[25]，如含苯基QACs需经历额外去苄基过程使其降解速率比普通QACs低[26]；厌氧环境下QACs几乎不发生生物降解；好氧生物降解率随非甲基烷基的增加而降低，且由于中间产物(苄胺等)对微生物的抑制作用而降解不完全[27]；QACs的质量浓度高于10 mg/L时会抑制污泥硝化作用(特别是亚硝酸盐氧化过程)[28]。因此，在活性污泥系统中，QACs的生物降解甚微，主要通过吸附至污泥而去除。有研究发现，典型苯基QACs苯扎氯铵在3 h的吸附率达40%，4 d的吸附率可达90%，吸附作用强度与QACs的结构及固相颗粒的理化性质有关[29]。

2.3 QACs生态毒理效应

水生生态系统中不同营养级的生物对QACs敏感性具有较大不同。QACs在96 h暴露时间内对藻类等初级生产者的半最大效应质量浓度(EC50)为20～200 μg/L、对水蚤等初级消费者的EC50为20～90 μg/L、对鱼类等次级消费者的EC50为40～280 mg/L[30-31]。QACs的EC50与其碳链长度、极化度等因素有关。由于持续输入与不断积累，页岩气开采区域和污水处理厂排水口附近的水生生态环境中可能存在较高浓度的QACs，水生生物始终暴露于该环境下会引发潜在生态风险。水体中QACs大于10 mg/L或沉积物QACs大于50 mg/kg时将抑制活性污泥、土壤中微生物呼吸酶、脱氢酶活性，并使硝化反应受阻[11]358。卢培利等[32]发现，苯扎氯氨对以氮源为基质的活性污泥微生物的硝化活性存在抑制，最低抑制质量浓度为6 mg/L，并通过拟合杀菌剂浓度与抑制率曲线得出苯扎氯氨对活性污泥的半抑制质量浓度(IC50)为19.35 mg/L。目前环境中QACs浓度水平相对较低，但微生物已有抗药性趋势[33-34]。而对页岩气开采所用压裂液来说，若其中的悬浮颗粒、乳化油珠等负电性的物质过多，QACs与之进行相互作用后会降低杀菌活性，且长期单独使用易产生抗药性。

QACs也是对哺乳动物细胞毒性最大的表面活性剂之一，可抑制线粒体呼吸作用、减缓氧化磷酸化、改变DNA结构进而使细胞凋亡[35]。部分哺乳动物口服QACs的半数致死量(LD50)分别为：大鼠250～1 000 mg/kg、小鼠150～1 000 mg/kg、豚鼠150～300 mg/kg、兔子和狗500 mg/kg[36]61。长期接触QACs的小鼠，其繁殖健康受到严重损害，且吸入QACs气溶胶后对小鼠肺部产生影响[37]。QACs对不同动物均表现出相似的皮肤刺激性，当溶液中QACs质量分数低于0.1%时不会对皮肤产生影响，但QACs达0.3%以上即可引起从皮肤刺激到坏死的各种反应[36]62。QACs对暴露的真核细胞具有潜在的遗传毒性作用，直接接触含有QACs的洗涤剂和高含量的QACs药物，可能会对人体造成潜在的DNA损伤效应[38-39]。

欧盟已在2000年将QACs列入优先污染物名单，但目前针对压裂返排水中QACs的研究十分有限，考虑到QACs对生态系统和人类健康的潜在危害，相关研究值得进一步加强。

3 戊二醛的杀菌机理、典型环境特性与生态毒理效应

3.1 戊二醛杀菌机理

戊二醛具有生物降解性和自聚合趋势，在高温、碱性的页岩气井下和地层环境中可迅速发生聚合，并沉淀出较大的聚合物[40]，因而在返回地表的压裂返排水中，戊二醛可能被完全耗尽或仅以水溶性低聚物形式存在。戊二醛可通过羟醛缩合、Michael加成等方式与细胞内成分如核酸、蛋白质等发生反应，使巯基、羟基、羧基和氨基等烷基化[41]。按作用靶点和细菌细胞结构的不同，戊二醛杀菌机理包括与细胞蛋白质及酶的作用、与肽聚糖的相互作用、与细胞质组分的相互作用。

具有高反应活性的戊二醛可与细菌等微生物的细胞壁、细胞膜氨基交联，从而损伤细胞壁并使细胞质凝固，抑制DNA合成[42]。但由于细胞壁/膜的屏障保护作用，戊二醛及其多聚物很难在没有主动运输、基团转位的情况下进入细胞内部。因此，戊二醛更多地是与肽聚糖反应来实现杀菌。戊二醛与胺、巯基间存在相互作用，可能对细胞壁暴露、缺乏保护层的有机体更具毒性。戊二醛穿透力差，在与QACs结合使用后可增强渗透力，提高杀菌活性，因此广泛应用于页岩气压裂液的配制。

3.2 戊二醛典型环境特性

戊二醛在土壤和沉积物中的吸着系数分别为380、120[43]30，介于中高迁移水平(吸着系数50～ 500)，因此其在两种介质中迁移率相对较高；戊二醛辛醇-水分配系数较低[44]，水溶性较高，故戊二醛具有较低的生物蓄积趋势，更倾向于保持在水相中。与QACs相比，戊二醛的生物可利用性更强，在好氧、厌氧条件下均可被微生物快速转化，准一级半衰期分别为10.6、7.7 h[43]35。在好氧条件下，戊二醛可先被微生物代谢为中间体戊二酸，再转化为二氧化碳；厌氧条件下先转化为5-羟基戊醛，再转化为1,5-戊二醇[45]。戊二醛在环境中的实际降解速率与其自身浓度水平和细菌的适应情况有关。

MCLAUGHLIN等[46]对页岩气开发压裂液中杀菌剂对农业土壤的污染进行了模拟研究，结果显示戊二醛与土壤中胺官能团交联后会被快速吸附，而后通过耐盐微生物体的代谢及与细胞共价结合两种方式被去除。戊二醛对SRB的最低抑制质量浓度为20 mg/L，但当其质量浓度超过5 mg/L时即会抑制污水处理中微生物活性，并对处理性能产生不利影响[43]31。虽然戊二醛无累积效应，但可抑制其他污染物的生物降解。在页岩气开发压裂液的使用浓度水平下，戊二醛对其他化合物的生物降解抑制速率随戊二醛浓度的增加而增大[9]10251。由于戊二醛常与其他杀菌剂联合使用，这些化合物的联合毒性作用以及可能转化形成更强毒性的副产品等是值得关注的问题。

3.3 戊二醛生态毒理效应

由于可被生物降解，且降解速度较快，戊二醛的生态影响潜力相对较小。在水生生态系统中，戊二醛在96 h暴露时间内对浮萍、藻类等初级生产者EC50为0.17～73.80 mg/L；对水蚤、牡蛎、端足虫等初级消费者EC50为0.75～289.00 mg/L；对斑马鱼、虹鳟鱼等次级消费者EC50为1.8～40.0 mg/L[47-49]。在戊二醛溶液中持续暴露21 d后，大型溞在0.21、1.06 mg/L下死亡率分别为10%、20%，而水蚤在4.25 mg/L下可全部存活，但出现明显繁殖抑制；鱼类在2.9 mg/L戊二醛溶液中暴露32 d后，出现幼体存活率降低现象[43]28。

戊二醛被认为具有潜在的致癌作用，虽然体外/体内生物测试方法没有发现其明确的遗传毒性[50]，但却具有一定发育毒性，对大鼠的出生活仔率、存活总数和牡蛎胚胎的存活率等均有影响[51]。根据体外实验研究，戊二醛可使细菌和一些培养的哺乳动物细胞系统产生DNA损伤，经戊二醛处理的牛心包会引起明显的毒性，出现炎症和钙化反应[52]。

4 页岩气水力压裂过程中杀菌剂潜在生态风险

页岩气开发的水力压裂过程可能会带来地下水、地表水、大气、土壤污染以及生态风险。但目前对页岩气等非常规天然气开采的生态风险评估尚不成熟，正处于以常规油气风险评估为基础不断完善的阶段。自2010年起，国内外开始对页岩气开采过程的生态风险进行评估，美国环境保护署(USEPA)通过对有关情景评估、实验室研究、毒性评估和案例研究等数据的收集，评估了水力压裂对饮用水资源的风险[53]；SUN等[54]在对页岩气开发各环节的环境影响进行调查后，采用关联矩阵法对影响进行了评价，并建立了一个自然生态环境与外部宏观环境的综合评价体系；ZIEMKIEWICZ等[55]使用事件树，对运输过程中的页岩气水力压裂流体在不同污染途径下的环境和公共风险进行了概率分析；张虹[56]通过构建页岩气开发风险概率模型，实现了对生态风险的定量表征，并提出了基于“源—路径—目标”的地表水污染风险评价方法；高晓斐[57]运用层次分析法、模糊综合评价法等对风险指标及所对应风险值进行量化，构建了一套页岩气开采风险评价模型。但总体来说，页岩气开采过程风险评估存在基础数据和评估方法上的不足。将实际化学污染物的潜在风险评估纳入其中，可更完整地实现对受页岩气开发所影响区域的生态风险评价。

可用于杀菌剂生态风险评价的方法包括熵值法、暴露-反应法、污染指数法、回归过量分析法[58]等，需要同时结合污染物的理化性质、生态毒理学特性和生态证据线来进行客观评价。BUTKOVSKYI等[59]将水力压裂化合物在地表水中的浓度预测值与不影响水中生物的浓度值进行比较，判定是否对环境有潜在风险；USEPA采用多标准决策框架，从化合物的相对毒性、检出概率、物理化学性质(流动性、挥发性、持久性等)3方面对压裂液、压裂返排水中的化合物进行评分，对水力压裂污染物的潜在危害进行分析。

目前阻碍杀菌剂开展生态风险评估的问题有：(1)杀菌剂等水力压裂化合物的具体使用浓度、频率、使用量等数据缺失。目前关于杀菌剂在井筒、储存池、各类废水处理系统中的存在形态、转化和浓度水平，以及进入环境的剂量等仍缺乏认识，压裂液、压裂返排水成分复杂，检测依然存在挑战。(2)水力压裂现场环境介质多样，物质存在多种迁移转化过程，很难确定其最终去向与影响范围。释放到环境中的杀菌剂可通过地表径流和地下径流造成污染。在低渗透性土壤区域，杀菌剂主要通过较大的径流作用到达附近水域，使地表水受到污染，并进一步通过地层间缝隙进入含水层，造成地下水污染；在高渗透性土壤区域，杀菌剂被吸附到土壤颗粒中或存在于土壤颗粒的孔隙间，使土壤受到污染；降水可进一步促使污染物的溶解，使其向地下水迁移。另外，被灌注至地下的压裂返排水及被滞留的压裂液可能通过岩石裂隙等向上移动，逐渐渗入含水层，对地下水造成污染。(3)现场实际生态参数难以评估。以地下水为例，虽然其样本可作为地表水环境中或土壤、沉积物孔隙中有机物暴露的替代物，但缺乏相关生物的数据，很少进行地下水毒性试验，难以掌握地下水生态系统的真实敏感性。

5 结论与展望

页岩气开采压裂液中多使用非氧化型杀菌剂，其中QACs和戊二醛应用最为广泛。两种杀菌剂常联合使用以增强渗透力、提高杀菌活性。QACs、戊二醛及其转化产物均具有毒性效应，能够抑制其他化合物的生物降解，其对微生物的抗性作用还会影响压裂返排水回用。

压裂液中杀菌剂具有潜在生态风险，基于典型单一条件下的物理化学和毒理数据难以代表高温、高压、高盐等复杂条件下的杀菌剂的实际形态、转化过程和毒理效应。因此，对页岩气开采业杀菌剂的潜在生态风险展开评估，需先克服当前杀菌剂使用信息(使用量、使用频率、浓度)的不对称、压裂返排水检测方法的不完善、杀菌剂在页岩气开发区域环境介质中的迁移转化过程的不确定性。后期研究应结合杀菌剂理化性质、生态毒理学特性和生态证据线来对其在不同介质中的迁移过程进行模拟，分析迁移距离、影响范围，从而更全面地实现杀菌剂的生态风险分析，为制定针对性防范措施提供理论基础。

随着我国环境风险管理要求日益严格，未来应进一步完善页岩气开采行业的生态风险形成机制和评估方法，并对我国现有水污染控制标准和压裂返排水处理处置技术工艺控制生态风险的能力进行评估，以服务我国页岩气的安全、绿色持续开发。