一种中药保湿抗衰组合物的制备及其在化妆品中的应用*

夏高辉，孔秋婵，陈庆生，龚盛昭

(1.广州环亚化妆品科技有限公司，广东 广州 510663; 2.广东轻工职业技术学院 轻化工技术学院，广东 广州510300)

皮肤是人体最大的器官，完整的皮肤屏障结构与功能不但对于维持10%～20%的正常皮肤含水量至关重要，而且可以形成完整的第一道防线抵御外界机械、化学、物理及生物等各种刺激对肌肤的伤害[1-3]。但由于受环境因素和机体自身健康状况影响，体内氧化和抗氧化系统平衡被打破，导致皮肤屏障系统出现损伤，角质层含水量低于10%，皮肤出现干燥、粗糙、皲裂、老化的现象。随着社会经济的发展和国民生活水平的提高，人们越来越重视皮肤的保养，同时对于化妆品质量和安全性能的要求也越来越高，因此使用天然护肤品已成为全球趋势。天然植物保湿抗氧化剂由于来源广泛，具有良好的补水抗氧化效果、亲肤、温和等优点[4-5]，日渐成为化妆品领域的宠儿。然而天然植物原料存在成分比较复杂、活性成分相对来说不稳定性、使用成本较高等问题，这些问题是阻碍天然化妆品发展的主要原因[6]。天然活性物化妆品开发和研究的关键是植物原料中复杂活性成分的提取分离、改善提取物的稳定性以及降低天然活性物在化妆品中的使用成本。得益于现代生物科技、提取分离技术、精制纯化手段及活性成分稳定化技术的发展，阻碍天然活性物化妆品发展的这一技术难题已逐步得到解决。

现代科学研究表明，玫瑰、铁皮石斛、芦荟、银耳等含有丰富的黄酮类、氨基酸类、多糖类成分，因此具有良好的保湿抗氧化功效[7-15]。笔者根据君臣佐使的中药配伍原则，将玫瑰、铁皮石斛、芦荟、银耳组合起来，研究提取工艺对组合物功效的影响，确定最优提取工艺，并将其应用于保湿抗衰类化妆品中，通过人体皮肤试验对中药保湿抗衰组合的功效进行验证，以得到具有良好保湿和抗衰功效的中药组合物，为化妆品行业保湿抗衰原料及天然植物原料开发应用思路的拓展提供一定的帮助。

1 实验部分

1.1 主要试剂与仪器

玫瑰花干花、银耳、铁皮石斛、芦荟干片：市售；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，98%：阿拉丁试剂有限公司；邻苯三酚、分析纯：阿拉丁试剂有限公司；盐酸、分析纯：广州精科生物科技有限公司；硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)、分析纯：广州精科生物科技有限公司；30% H2O2、分析纯：广州精科生物科技有限公司；水杨酸、分析纯：广州精科生物科技有限公司；0.05 mol/L pH=8.2的Tris-HCl缓冲溶液：广州精科生物科技有限公司；磷酸氢二钠、分析纯：广州精科生物科技有限公司；磷酸二氢钠、分析纯：广州精科生物科技有限公司。超声波清洗机DL-360E：上海之信仪器有限公司；HWS 24型水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；皮肤水分含量Corneometer测试探头：德国Courage+Khazaka公司；皮肤水分流失(YEWL) Tewameter TM 300测试探头：德国Courage+Khazaka公司；CK 皮肤水份测试探头Cutometer MPA 580：德国Courage+Khazaka公司。

1.2 中药保湿抗衰组合物提取物的制备

按配比称取玫瑰花、银耳、铁皮石斛、芦荟干片共10 g，混合后粉碎，得到药材混合物；将药材混合物置于圆底烧瓶中，加入15倍量的乙醇溶液，在水浴回流条件下连续超声(超声功率90 W)辅助提取1～3次，每次45～90 min，过滤得到粗提取液；将粗提取液在70℃条件下减压蒸馏浓缩至10 mL，将上述浓缩液经D101型大孔树脂柱纯化以除去会对后续应用产生不利影响的无机盐类等物质，用乙醇溶液洗脱，收集洗脱液；在55℃条件下减压蒸馏至10 mL，得到中药保湿抗衰组合物提取物。

1.3 中药组合物配比筛选

根据中药君臣佐使组方原理将四味中药配伍运用，以玫瑰为君药，玫瑰具有良好的保湿、抗氧化效果；以铁皮石斛为臣药，铁皮石斛富含石斛多糖、氨基酸等成分，滋润肌肤和抵抗衰老；以芦荟为佐药，缓解皮肤干燥、延缓肌肤衰老；以银耳为使药，银耳的主要成分为银耳多糖，是一种植物源性高效保湿剂，分子量达到100～130万，并且分子中富含大量的极性基团例如羟基、羧基等，这些基团容易与水分子形成氢键，从而结合大量的水分，银耳多糖分子间以网状结构的形式相互交织，于此同时与水分子中的氢结合，从而呈现出强大的保湿锁水能力和比较高效的保湿功效。通过研究不同中药组分配比对组合物抗氧化功效的影响筛选最佳中药组分配比。具体实验设计见表1。药物准备及提取方法见1.2。

表1 实验设计

1.4 提取过程中各因素对提取效果的影响

组合物的提取效果受提取过程中各因素的影响，其中提取溶剂、提取时间以及提取次数等因素对提取效果的影响较大，因此笔者以提取过程中的乙醇浓度(A/%)、提取时间(B/min)、提取次数(C/次)为考察对象，以提取物的超氧阴离子自由基清除能力和羟自由基清除能力为综合考虑指标，选用L9 (34)正交试验表进行试验，从而筛选出最佳提取工艺，正交试验因素与水平见表2。药物准备及提取方法见1.2。

表2 正交试验因素与水平

1.5 抗氧化功效评价试验

1.5.1 超氧阴离子自由基清除能力评价试验

取0.05 mol/L pH 8.2的Tris-HCl缓冲溶液4.5 mL，于25℃水浴锅中预热30 min。再加入1 mL样品溶液和0.4 mL 25 mol/L的邻苯三酚溶液，混匀后，于25℃水浴中反应5 min，加入1 mL 8 mol/L的HCl终止反应。以Tris-HCl缓冲溶液作参比，在299 nm处测吸光度值。空白对照组用1 mL样品溶液的溶剂来替代样品溶液。

超氧阴离子自由基清除率的计算公式如式(1)所示：

超氧阴离子自由基清除率(%)=

[1-(A1/A0)]×100%)

(1)

式(1)中，A1为样品组的吸光度值，A0为空白对照组的吸光度值。

1.5.2 羟自由基清除能力评价试验

在25 mL比色皿中依次加入2 mmol/L FeSO43 mL，1 mmol/L H2O23 mL，摇匀，接着加入6 mmol/L水杨酸3 mL，摇匀，于37℃水浴加热15 min后取出，测其吸光度；分别加入一定浓度的样品溶液，摇匀，继续水浴加热15 min，取出测其吸光度。

羟自由基清除率的计算公式如式(2)所示：

羟自由基清除率(%)=

(2)

式(2)中，A0、Ax、Ax0分别为未加样品前反应体系的吸光度值、样品清除羟自由基后体系的吸光度值、样品溶剂清除羟自由基后体系的吸光度值。

1.6 在精华液中的应用

配方组成见表3。将添加相原料羟苯甲酯和羟苯丙酯预先在丁二醇中加热溶解至澄清透明，备用；将水相原料投入至去离子水中，加热至75～85℃，搅拌至溶解均匀；保温10 min，水相降温至60℃，边搅拌边缓慢加入已预先在丁二醇中溶解好的羟苯甲酯和羟苯丙酯，搅拌至溶解均匀；冷却至40℃，加入中药保湿抗衰组合物，搅拌均匀，即得保湿抗衰精华液待测样。将配方中的中药保湿抗衰组合物以去离子水代替，按照相同的方法制得保湿抗衰精华液对照样。

表3 保湿抗衰精华液配方

1.7 人体皮肤保湿抗衰效果测试

1.7.1 皮肤水分含量及皮肤水分流失(TEWL)试验

皮肤水分含量及皮肤水分流失(TEWL)试验，水分测试采用的是世界公认的CORNEOMETER®法——电容法，皮肤水分流失(TEWL)对于皮肤角质层功能的评估是一个非常重要的参数，在国际上已经得到了非常广泛的认可[16-18]。皮肤角质层的功能越良好，试验测到的角质层水分的含量就会越高，相应的皮肤水分流失(TEWL)的数值就会越低。试验采用的测试仪器为皮肤水分含量Corneometer测试探头和皮肤水分流失(TEWL) Tewameter TM 300测试探头(德国Courage+Khazaka公司)。

测试方法具体为：

选取干性肌肤志愿者(刺痛感累计≥3分者)20名，年龄控制在20～45岁，男女比例各50%。要求受试志愿者受试部位在测试前15天不能使用任何产品(化妆品、外用药品、内服保健品)。试验前，要求受试志愿者对面部进行清洗并在清洗后2 h进入气候控制室(22±1℃，相对湿度50%)静坐20 min以上，并保持放松状态。

试验中按随机表进行半边脸测试，一侧为样品，另一侧为对照，选取志愿者的左右鼻唇沟部分进行皮肤水分含量及水分流失(TEWL)测试，取3个值的平均值作为左右鼻唇沟水分含量数据(d0)及鼻唇沟皮肤水分流失(TEWL)的数据(d0)。测试结束后，志愿者需按要求使用，一侧脸涂抹样品，另一侧脸涂抹对照品。连续使用63天，并要求试验者在试验的第7天(d7)、第14天(d14)、第21天(d21)、第28天(d28)、第35天(d35)、第42天(d42)、第49天(d49)、第56天(d56)及第63天(d63)进行回访。

1.7.2 皮肤弹性测试

选取外眼角有皱纹人群(两侧皱纹等级为1～7之间，且左右两侧皱纹等级相同者)20名，年龄在30～60岁，男女比列各50%。受试部位前15天不能使用任何产品(化妆品、外用药品、内服保健品)。试验前，要求受试志愿者对面部进行清洗并在清洗后2 h进入气候控制室(22±1℃，相对湿度50%)静坐20 min以上，并保持放松状态[19]。

试验中按随机表进行半边脸测试，一侧为样品，另一侧为对照，选取志愿者的左右脸颊、眼角进行皮肤弹性测试，测试三次取平均值作为左右眼角皮肤弹性数据(d0)。测试结束后，志愿者需按要求使用，一侧脸涂抹样品，另一侧脸涂抹对照品。连续使用63天，并要求试验者在试验的第7天(d7)、第14天(d14)、第21天(d21)、第28天(d28)、第35天(d35)、第42天(d42)、第49天(d49)、第56天(d56)及第63天(d63)进行回访。

1.7.3 数据统计

利用SPSS 17.0统计软件进行方差分析，通过t检验对志愿者测试所得数据进行评估。统计结果通过皮肤水分值含量变化、皮肤水分流失变化和皮肤弹性变化说明中药保湿抗衰组合物的保湿抗衰功效。

2 结果与讨论

2.1 不同中药配比对组合物抗氧化功效的影响

以获得组合物的抗氧化能力(超氧阴离子自由基和羟自由基清除率)为综合指标，筛选中药组合物的最优组分配比。具体结果如表4所示。由表4结果可以看出，5、6、9号组合物对超氧阴离子自由基清除率较高，5、7、8号组合物对羟自由基清除率较高，综合考虑选择5号组合物的配比作为最优配比，即m(玫瑰)：m(铁皮石斛)：m(芦荟)：m(银耳)=4:3:2:1。君药是指在处方中对主证或主病起关键治疗作用的药物，药力居方剂组分之首，是不可或缺药物；臣药是指辅助君药可有效强化主病和主证治疗效果的药物；佐助药是指治疗次要兼证药物；使药主要作用在引组方药物直达病所或调和诸药作用，用量最少却又不可缺少。元朝李杲认为“君药，分量最多，臣药次之，使药又次之，不可令臣过于君，君臣有序，相与宣摄，则可以御邪除病矣”。由实验结果来看，四种中药的最优配比正符合中药君臣佐使的药量规律，玫瑰具有良好的保湿和抗氧化效果，对于组合物的保湿和抗氧化功效影响最大，因此在组合物中不可或缺且占的比例最大；铁皮石斛在抗氧化方面的功效较好，作为臣药增强玫瑰的抗氧化效果；芦荟具有镇静舒缓的功效，可以缓解肌肤炎症带来缺水和衰老症状；银耳具有高效保湿功效，可以迅速为肌肤补充水分，短时令肌肤水分充盈，消除肌肤干燥带来不适。

表4 不同配比组合物的自由基清除率

2.2 正交试验结果

以超氧阴离子自由基清除率为指标的正交试验分析结果见表5、表6，通过对中药保湿抗衰组合物超氧阴离子自由基清除率的测定，得出每个试验的超氧阴离子自由基清除率，也即中药保湿抗衰组合物的抗氧化能力，由正交试验结果和方差分析结果可知，A2>A3>A1，B1>B3>B2，C3>C2>C1。主次因素依次为C>A>B，即提取次数影响最大，其次为乙醇浓度，提取时间影响最小；由方差分析表结果可知，F0.05(2，4)≥FA>F0.10(2，4)，F0.05(2，4)≥FC>F0.10(2，4)，F0.25(2，4)≥FB，因此A和C属于对提取工艺影响显著的因素，而B因素对提取工艺的影响不显著,无统计学意义。因此以抗氧化能力为指标的最优提取工艺组合为：A2B1C3，即用15倍量60%乙醇超声辅助加热回流提取3次，每次45 min。在最佳提取工艺条件下，组合物提取物的超氧阴离子自由基清除能力最强的原因可能是此时中药中的具有抗氧化功效的多糖类、黄酮类等有效成分溶出率更高，因而抗氧化效果更佳。

表5 正交试验方案与结果

表6 方差分析结果

2.3 验证性试验

将提取量扩大为20倍，按照最优提取工艺条件组合A2B1C3重复试验3次，进行验证性试验，结果显示中药保湿抗衰组合物提取物的超氧阴离子自由基清除率分别为91.67%，92.03%，91.89%，平均值为91.86%，RSD值为0.1975%(n=3)，高于表中的任何组合，表明该工艺可靠，重复性良好。

2.4 人体皮肤保湿抗衰效果测试

2.4.1 皮肤水分含量变化

人体皮肤水分含量变化见图1。由图1可知，使用对照样品，皮肤中水分值略有增加，但是无明显变化趋势，使用至28天皮肤水分值提高15%左右，继续使用至63天皮肤水分值提高19%左右；与对照样品相比，使用中药保湿抗衰精华液能明显提高皮肤水分值，且随着时间推移，皮肤水分值不断增加，使用28天皮肤水分值提高39%左右，继续使用至63天皮肤水分值增加值稳定至47%左右。通过统计学分析可知，在实验第35、42、49、56、63天时有显著性差异(P<0.05)，说明添加具有保湿和抗衰功效组合物的保湿抗衰精华液具有提高皮肤水分含量的功效，进而可以看出本研究中的组合物有良好的保湿功效。

图1 皮肤水分值变化

2.4.2 皮肤经皮水分流失变化

经皮水分流失(TEWL)被定义为经被动扩散通过皮肤输运的水分。一般皮肤屏障功能好的TEWL较低，皮肤屏障损伤的皮肤TEWL会升高。因而可以用TEWL的变化反映皮肤屏障功能的变化。TEWL变化结果见图2。由图2结果可知，使用对照样品，TEWL略有降低，但是降低趋势不明显，使用至28天TEWL降低7%左右，继续使用至63天TEWL仅降低10%左右，说明使用对照样品皮肤屏障功能提升不明显；与对照样品相比，使用中药保湿抗衰精华液能明显降低TEWL，且随着时间推移，TEWL不断降低，使用28天TEWL降低27%左右，继续使用至63天TEWL降低量逐步稳定至33%左右。通过统计学分析可知，在实验第21、28、35、42、49、56、63天时有显著性差异(P<0.05)，说明添加中药保湿抗衰组合物的精华液明显增强了皮肤的屏障功能，提升了皮肤的保水能力，可以看出本研究中的组合物有良好的增强皮肤屏障功能的功效。

图2 皮肤经皮水分流失变化

2.4.3 皮肤弹性变化

皮肤弹性表征值R2用于表示在测试中皮肤被拉伸后回复能力的大小。越是年轻的皮肤，弹性好的皮肤，R2越大；反之，越是年老的皮肤，弹性差的皮肤，R2越小。皮肤弹性表征值R2变化结果如图3所示。由图中连续使用保湿抗衰精华液和对照样品63 天R2的变化趋势可以看出，使用对照样品63天R2的变化不大，连续使用28天提升7%左右，连续使用63天提升仅为10%左右；使用保湿抗衰精华液63天R2的提升较为明显，连续使用28天提升20%左右，连续使用63天后R2的提升幅度达到30.5%。通过统计学分析可知，在实验第42、49、56、63天时有显著性差异(P<0.05)，说明通过皮肤弹性的对比试验结果可以证明添加中药保湿抗衰组合物的精华液对皮肤弹性有明显的提升效果，由此可以看出该研究中的组合物有良好的提升皮肤弹性的效果，具有良好的抗衰功效。

图3 皮肤弹性变化

3 结论

(1)以超氧阴离子自由基和羟自由基清除率为衡量指标，采用传统中药君臣佐使的配伍理念，研究中药保湿抗衰组合物的配比对抗衰效果的影响，筛选出各中药的最佳质量配比为m(玫瑰)：m(铁皮石斛)：m(芦荟)：m(银耳)= 4∶3∶2∶1。玫瑰为君药，铁皮石斛为臣药，芦荟为佐药，银耳为使药。

(2)以超氧阴离子自由基清除率为衡量指标，采用正交试验法研究乙醇浓度(A/%)、提取时间(B/min)、提取次数(C/次)对中药保湿抗衰组合物提取工艺的影响。由正交试验结果和方差分析结果可知，提取次数影响最大，其次为乙醇浓度，提取时间影响最小；由方差分析表结果可知，提取次数和乙醇浓度属于对提取工艺影响显著的因素，而提取时间对提取工艺的影响不显著无统计学意义，优选出的最佳提取工艺为：用15倍量60%乙醇超声辅助加热回流提取3次，每次45 min。按照最优提取工艺重复试验3次进行验证，结果显示中药保湿抗衰组合物提取物的平均超氧阴离子自由基清除率为91.86%，表明优选出的最优工艺可行，适合满足工艺大生产的要求。

(3)试验制得的添加中药保湿抗衰组合物的精华液具有良好的保湿效果和增加肌肤弹性的效果，表现出较好的保湿抗衰性能(P<0.05)。