中药抗流感病毒活性研究方法发展现状

钱秀玉，聂黎行*，张 毅，戴 忠，马双成

（1.中国食品药品检定研究院，北京 100050；2.重庆市食品药品检验检测研究院，重庆 401121）

流行性感冒病毒简称流感病毒，属正黏病毒科，包括人流感病毒和动物流感病毒。人流感病毒根据其核蛋白的抗原性分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，是流行性感冒的病原体。其中，甲型流感病毒抗原性易发生变异且传染性较强，是引发季节性流感和全球大流行的主要病毒[1]。高变异性和高致病性流感病毒的流行，将会造成巨大的社会健康危机和生命损失。20世纪至今，已爆发多次流感世界大流行，1918年在西班牙爆发的H1N1流感直接或间接造成全世界近5000万人口死亡，此后1957，1968和2009年的3次大流感疫情也造成了巨大损失。据世界卫生组织报道，每年有29～65万人的死亡与流感引起的呼吸道疾病有关[2]，对全球人类的健康造成严重的威胁。

中药在流感治疗中发挥着重要作用。许多单味中药和复方中药，如板蓝根、黄芩、金银花、连翘、连花清瘟胶囊、银翘散、双黄连制剂等[2]，在临床上广泛用于流感的预防与治疗，通过直接抑制病毒作用或/和免疫调节作用，发挥抗流感病毒作用，临床效果明显。研究中药抗流感病毒活性和机制有利于新药发现和指导药物临床应用，提高疾病的治愈率。目前，按照研究对象分类，现有的中药抗流感病毒活性和机制研究方法可分为体外、体内及酶/蛋白质/mRNA方法。体外方法多以细胞/细胞系为模型，体内方法包括鸡胚、小鼠、大鼠、树鼩等模型和人体临床试验。本文将对中药抗流感病毒活性和机制研究的多种方法进行详细综述，以期为相关研究提供有益参考。

1 流感病毒概述

流感病毒是正黏病毒科的分节状单链负义RNA病毒，由包膜、基质蛋白及核心3个部分构成。包膜除磷脂分子外，含有两个重要的糖蛋白：血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）。HA水解后的重链部分与宿主细胞膜上的唾液酸受体相结合，轻链部分协助病毒包膜与宿主细胞膜相互融合，在病毒进入宿主细胞过程起重要作用[3]。NA是呈蘑菇状的四聚体，可催化唾液酸水解，协助成熟流感病毒与宿主细胞脱离，释放成熟流感病毒。基质蛋白（M1）和膜蛋白（M2）组成病毒的外壳骨架，保护病毒核心和维系病毒空间结构。病毒核心中的遗传物质单股负链RNA（ss-RNA）和核蛋白（NP）相结合，形成核糖核蛋白体（RNP）。此外，核心中还含有负责RNA转录的RNA多聚酶[4]。

流感病毒感染宿主细胞的过程为吸附、内吞、融合、复制、翻译、装配、出芽和释放[5]。目前抗病毒小分子药物有NA抑制剂、M2 离子通道阻滞剂、HA抑制剂、NP抑制剂等[6]。A/PR/8/34（H0N1）、A/FM/1/47（H1N1）、A/Hongkong/1/68（H3N2）、A/Anhui/1/2013（H7N9）等是甲型流感病毒亚型代表病毒株。流感病毒能在鸡胚羊膜腔和尿囊腔中增殖，可在组织培养细胞（人羊膜、猴肾、狗肾、鸡胚等细胞）中增殖，在雪貂、小鼠及大鼠体内易感[7]。

2 体内/体外研究模型

2.1 体外研究模型

犬肾细胞（MDCK细胞）、RAW264.7细胞（单核巨噬细胞）、16HBE细胞（人支气管上皮样细胞）、非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）等是常见的抗流感病毒体外细胞/细胞系模型，用于流感病毒感染和增殖，其中MDCK细胞最为常用[8-10]。体外细胞/细胞系模型主要应用于中药抗流感病毒药物安全性评价、抗病毒活性及作用机制研究。细胞存活率、生长抑制率、细胞保护率、病毒载量等常作为表征中药的抗流感病毒活性的指标。

2.1.1 细胞病变效应（CPE） 肖平等[11]研究板蓝根活性部位及代表性化合物抗流感病毒活性，用CPE法测定药物作用后的存活病毒，并按Reed-Muench法[12]计算滴度（TCID50），采用CPE法评价其治疗作用，以细胞保护率为评价指标，结果表明，FM1病毒感染细胞后观察到明显的细胞病变，经Clemastanin B、表告依春、苯丙素类组分、苯丙素类+生物碱+有机酸组分处理后，均未见明显的CPE形成。其中，苯丙素类组分对细胞的保护作用最为显著，说明以上组分对流感病毒有一定的抑制作用。

2.1.2 四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法） 李征途等[13]通过MTT法检测板蓝根多糖对16HBE细胞的细胞毒作用，将16HBE细胞接种到96孔板培养，不同浓度的板蓝根多糖作用于细胞，培养后加入MTT溶液，孵育后吸去上清，将甲臜晶体溶解于DMSO中，使用96孔微板分光光度计在570 nm波长下测量吸光度。结果表明，在3.75～30 mg/ml浓度范围内，板蓝根多糖对16HBE细胞没有明显的细胞毒性。魏文扬等[14]采用MTT法研究麻黄汤体外抗甲型H1N1流感病毒作用。结果表明，在为2.50～5.00 g/L浓度范围内，麻黄汤通过抗病毒生物合成抑制流感病毒，且抑制作用强于阳性药物达菲。

2.1.3 流式细胞术 刘晓静等[15]研究3种中药（金银花、黄芩和连翘）提取液的抗流感病毒作用，试验中用药物和病毒分别作用和感染MDCK细胞，同时设置细胞对照组（细胞）、病毒对照组（病毒+细胞）、药物对照组（药物+细胞）、药物试验组（药物+病毒+细胞），以利巴韦林作为阳性药物对照，细胞病变达1/3时收集细胞，用Annexin V/PI（Annexin V/PI与正常和凋亡细胞的结合情况不同）双染细胞并用流式细胞仪测定细胞凋亡率，计算3种提取液对由流感病毒引起的MDCK细胞凋亡抑制率。结果表明，浓度为7.81 g/L的黄芩和连翘提取液对甲3型流感病毒诱导的MDCK细胞凋亡有抑制作用。杨慧等[16]采用流式细胞术研究鱼腥草抗甲Ⅰ型流感病毒诱导的MDCK细胞凋亡作用，计数鱼腥草作用后病毒感染的MDCK细胞，计算细胞凋亡率。结果表明，药物试验组比病毒感染对照组细胞凋亡率偏低且差异有统计学意义，说明鱼腥草能抑制由甲Ⅰ型流感病毒诱导的MDCK细胞凋亡。周艳萌等[17]采用流式细胞术研究厚朴及其提取物体外抗流感病毒H1N1机制，检测药物作用病毒感染对MDCK细胞细胞周期的影响，计算细胞增殖指数PI（PI为S期和G2/M期细胞与总细胞数的百分比），结果表明，厚朴酚和厚朴水浸液作用感染细胞的PI均高于病毒对照组，说明其抗流感病毒作用可能是通过调整细胞周期实现的。

2.1.4 病毒空斑试验 杨子峰等[18]研究来源于板蓝根的成分Clemastanin B抗人和禽类流感病毒的活性，在24孔板接种MDCK细胞，孵育后用病毒感染，在感染前1 h、与病毒同时加入或在感染后的特定时间点加入Clemastanin B，药物作用后，收集上清，用空斑试验测定感染滴度。结果表明，病毒感染后加入Clemastanin B处理细胞，检测到子代病毒滴度明显下降，说明Clemastanin B在体外对流感病毒引起的感染有一定的抑制作用。

2.2 体内研究方法

2.2.1 鸡胚模型 聂黎行等[19]研究板蓝根中一对硫代葡萄糖苷异构体（表原告依春、原告依春）及其降解产物（表告依春、告依春）抗甲型流感活性及其作用机制，采用鸡胚模型评估4种化合物在体内的抗病毒效力，选用10日龄胚胎接种流感病毒（H1N1），3种方式给药：（1）先用样品处理胚胎，孵育后用病毒感染；（2）先接种病毒，孵育后加入样品作用；（3）先将病毒和样品作用，孵育后将混合物加入鸡胚孵化。充分孵化后，吸取尿囊液进行血凝试验。结果表明，板蓝根中的4种化合物在鸡胚内对甲型H1N1流感病毒没有预防或治疗作用。但样品+病毒混合液处理鸡胚后发现，在最低考察浓度（0.625 mg/ml）下，表原告依春、原告依春、表告依春和告依春的抑制率分别为0，100 %，25 %和50 %，抗病毒效力大小顺序为：原告依春＞告依春＞表告依春＞表原告依春。张兵等[20]以鸡胚为模型，研究白及提取物体外抗流感病毒药效，选用9日龄SPF级鸡胚，将不同浓度提取液与病毒液混合，接种于鸡胚尿囊腔，孵育后，吸取尿囊液，用凝血试验测定血凝效价，用PCR技术扩增病毒核酸，定量核酸量（Ct值）。结果表明，白及水提物和醇提物均有一定的抗流感病毒活性。赵炎军等[21]研究金荞麦提取物抑制鸡胚中流感病毒增殖作用，结果显示，金荞麦提取物中、高浓度均能明显降低鸡胚尿囊液的血凝滴度，提示金荞麦提取物在体外有明显的流感病毒抑制作用。Jadhav等[22]研究磷脂酰胆碱（PC）结合圣罗勒甲醇提取物抗鸡胚接种H1N1流感病毒的效力。结果表明，圣罗勒在实验浓度下对H1N1流感病毒无抑制作用。

2.2.2 小鼠/大鼠模型 Chen等[23]使用束缚应激小鼠为易感性小鼠模型，流感病毒A/FM/1/47（H1N1）鼠肺适应株感染小鼠，评价抗病毒口服液（KBD）的抗流感病毒作用。结果表明，与“束缚应激+病毒”组相比，KBD高剂量治疗组小鼠的病情较轻，存活率提高35.7 %，平均死亡天数延长至（19.3±4.4）d。而KBD对正常小鼠感染后的死亡率和发病率没有显著影响，说明KBD对易感小鼠抗病毒作用更强。李玲等[24]进行抗病毒性肺炎的中药复方筛选及作用机制研究，采用免疫抑制小鼠，用流感病毒A/PR/8/34鼠肺适应株感染。各中药复方处理小鼠模型，同时设置正常小鼠组、肺炎模型组（未用药物处理）和阳性药物（奥司他韦）组，筛选出能有效抗流感病毒性肺炎的麻杏石甘汤。进一步研究表明，病毒感染后模型组小鼠体重和胸腺指数明显下降，肺指数和脾脏指数均明显升高，而高、中剂量麻杏石甘汤处理后，小鼠体重、胸腺指数和脾脏指数上调，肺指数下调，与阳性药物奥司他韦相当。肺组织病理变化表明，模型组肺部炎症明显，肺泡结构损伤严重，而3个剂量的麻杏石甘汤均能改善肺部炎症，中、高剂量与阳性药物奥司他韦作用相当，且麻杏石甘汤能调节细胞因子的分泌。提示麻杏石甘汤可能通过提高机体免疫功能、调节细胞因子的分泌与表达，减轻肺部炎症，改善机体状况，起到抗流感病毒性肺炎的作用。程淼等[25]研究板蓝根对流感病毒鼠肺适应株（FM1）所致的肺炎小鼠病理损伤修复作用，观察板蓝根对小鼠气管、肺组织病理损伤的影响，结果表明，光镜下观察，板蓝根作用后，肺组织病变较模型组同期明显减轻，逐渐呈恢复趋势；气管扫描电镜下观察到，板蓝根作用后气管表面形态学病变较模型组明显减轻，说明板蓝根能修复流感病毒所致肺炎小鼠的肺组织、气管病理损伤。Fu等[26]研究3种中药复方治疗流感病毒感染小鼠的免疫学机制，用FM1病毒株感染正常小鼠和TLR7基因敲除小鼠，用3种中药复方治疗。结果表明，奥司他韦、桂枝麻黄汤和银翘散对病毒感染的正常小鼠和TLR7基因敲除小鼠治疗效果有显著差异，提示中药对流感病毒感染所致炎症的治疗作用需TLR7信号的参与。Zhi等[27]研究富含黄酮类化合物的黄芩提取物（FESR）抗甲型流感病毒所致急性肺损伤的作用。采用超高效液相色谱-电喷雾线性离子肼质谱联用（UHPLC-ESILTQ/MS）分析FESR在正常小鼠和H1N1小鼠适应株（A/FM/1/47）感染小鼠的体内代谢过程，并探讨了其代谢活化机制。结果表明，代谢产生的反互补苷元可能是FESR治疗甲型流感病毒感染的潜在有效物质。张世鹰等[28]研究麻黄先煎之麻杏石甘汤的抗流感病毒机制，大鼠灌胃给予各组药物，静脉取血制备含药血清，含药血清作用于各组[空白对照组、Toll样受体7/8（TLR7/8）激活剂干预组、TLR7抑制剂干预组、TLR8抑制剂干预组、病毒干预组]A型流感病毒小鼠肺适应株（A/PR/8/34）感染的巨噬细胞，检测巨噬细胞TLR7/8介导的α/β干扰素（IFN-α/β）的分泌及蛋白表达，结果表明，麻黄先煎之麻杏石甘汤含药血清对其分泌水平与蛋白表达有显著的调控作用，说明这可能是麻杏石甘汤抗流感病毒作用机制之一。谢惠珺等[29]研究银翘散体外抗甲型流感病毒的作用，建立了甲型H3N2流感病毒株（A/Aichi/2/68）感染BALB/c小鼠肺炎模型，感染后观察感染小鼠生存状态及检测肺指数。结果表明，银翘散大剂量可减轻全身症状，降低肺指数，提示银翘散有体内抑制流感病毒H3N2复制的作用。

2.2.3 树鼩模型 研究发现H1N1、H5N1、H9N2和H7N9均能在树鼩模型上高效复制，为流感病毒的研究提供了有用的替代模型[30-33]。李际强等[34]以H3N2流感病毒感染树鼩，建立流感病毒树鼩模型，研究升降散的抗流感病毒作用。结果表明，升降散治疗的两只树嗣的体温未出现大的明显的波峰，说明升降散可能在退热方面有较好的效果。相比于对照组，升降散组树鼩病变较轻，仅有肺泡扩大，说明升降散可能对肺部炎症有改善作用。

2.2.4 临床试验 临床试验是检验药物作用的金标准，用于中药在人体内抗流感病毒作用的安全性与有效性研究。选择一定数量的流感患者，分为治疗组和阳性药物对照组，观察治疗前后患者临床症状变化，监测有无药物不良反应，以此评价药物的治疗作用及人体安全性[35-36]。王守军[37]研究连花清瘟胶囊抗流感病毒药理机制，选取100例流感患者，随机分为治疗组和对照组（磷酸奧司他韦胶囊），每组50例。结果表明，治疗组治疗有效率为98 %，高于对照组，且治疗组退热时间、呼吸道症状改善时间、临床症状改善时间、住院时间均短于对照组，说明连花清瘟胶囊治疗流感病毒引发的流行性感冒效果显著，值得临床推广应用。Wang等[38]观察中药复方安替威治疗流感的临床疗效与安全性，采用随机、双盲、安慰剂对照的方法，选取流感样病人和流感患者480例，随机分配安替威颗粒和安慰剂，观察疾病的症状的严重程度及康复患者数量。结果表明，对于流感确诊患者，与安慰组相比，安替威颗粒的疗效显著提高，患者康复率更高且显示出疾病严重程度的减轻（发烧、咳嗽、咳痰的改善率高于安慰剂组），试验过程中未出现严重的不良反应症状，表明安替威颗粒有显著的临床抗病毒效果，且总体耐受性良好。

2.3 分析技术

2.3.1 血凝抑制试验 HA是流感病毒表面的重要的糖蛋白，可与宿主细胞膜的唾液酸结合，并协助病毒包膜与宿主细胞膜融合，在病毒生命周期起着重要作用[39]。不同亚型流感病毒HA与宿主表面的对应受体结合引起血凝现象。当药物与HA结合，抑制流感病毒的凝血作用，表现出抗流感病毒活性。血凝抑制试验以流感病毒悬液、药物和红细胞为试验对象，向病毒悬液中加入药物，观察红细胞凝血现象，以红细胞凝血程度为评价指标，表示药物抗该亚型流感病毒的活性[40]。杨子峰等[41]采用血凝抑制试验研究板蓝根提取物S-03体外抑制甲、乙型流感病毒感染的活性，结果表明板蓝根提取物对不同亚型人流感病毒HA有抑制作用，最低抑制浓度为3.12～25 mg/ml。孙琴等[42]用血凝抑制试验研究板蓝根中fructopyrano-(1→4)-glucopyranose（FG）的体外抗病毒活性。结果表明，FG对流感病毒血凝素有明显的抑制作用，最小抑制浓度为3.1 mg/ml。

2.3.2 NA抑制试验 NA是存在于流感病毒表面的另一种关键蛋白质，可催化唾液酸水解，协助成熟流感病毒脱离宿主细胞，是抗流感病毒药物作用靶点之一[43-44]。体外NA检测法是抗流感病毒中药筛选和活性评价的常用方法[45-47]。李寒冰等[48]基于NA抑制试验建立板蓝根品质的生物评价方法。结果表明，板蓝根体外抑制NA的IC50为（0.90±0.20）mg/ml（生药），板蓝根乙醇提取物有明显的体外抑制NA活性，建立的生物效价检测方法可用于板蓝根的品质评价。

超滤质谱技术是将超滤装置与质谱分析结合的新方法，可实现中药中NA抑制剂的在线高通量筛选。马丽娜等[49]采用超滤-MS技术筛选板蓝根中抗流感病毒的活性成分，筛选并鉴定出与NA结合的成分主要是精氨酸、告依春和腺苷。刘舒等[50]采用超滤质谱联用技术研究复方板蓝根颗粒剂中黄酮和正丁醇提取物的NA抑制活性，结果表明，提取物中化合物的代谢物黄酮苷元具有较强的NA结合活性。张语迟等[51]基于超滤-LC/MS从女贞叶中筛选潜在的NA抑制剂，鉴定了13个化合物为NA抑制剂。Zhao等[52]采用二维HPLC-超滤-电喷雾电离飞行时间/质谱（ESI-TOF/MS）方法，全面富集、筛选和表征金银花不同极性组分中NA抑制剂，共鉴定出44个化合物具有NA抑制活性，该方法为从复杂的中药化合物中筛选出微量NA抑制剂提供了参考。

固定化酶技术通过物理吸附、包埋、交联等方法，将酶固定到水不溶性载体上并保持酶活性[53]。NA固定化酶反应器与毛细管或高效液相色谱结合，将NA固定到毛细管内或者色谱柱内[54-55]，包含底物4-甲基香豆素基-α-D-神经氨酸（MUNANA）、药物的反应液流经固定化酶，通过检测反应产物4-甲基伞形酮（4-MU）含量筛选具有抗NA活性的药物。如赵海燕等[56]将毛细管电泳与固定化酶微反应器相结合，从中草药中筛选出6个有抑制NA活性的化合物，抑制活性大小顺序为补骨脂二氢黄酮甲醚＞补骨脂二氢黄酮＞黄芩素＞黄芩苷＞白杨素＞牡荆素。赵瑜梅等[57]制备了NA微反应器，基于LC-MS/MS建立活性评价方法，并应用于金银花抗流感病毒活性成分的筛选。经NA微反应器筛选并进行活性测试，木犀草苷、木犀草素、异绿原酸、异绿原酸表现出较好的NA抑制活性。

2.3.3 酶联免疫吸附测定（ELISA） 张美义等[58]研究金翘片体内抗流感病毒作用机制，采用双抗夹心ELISA法检测流感病毒感染后小鼠肺组织和血清中γ-干扰素（γ-IFN）的水平。结果表明，金翘片能通过提高感染小鼠γ-IFN水平，发挥抑制流感病毒作用。王永锋等[59]研究栀子苷治疗流感病毒引起肺损伤的作用机制。结果表明，栀子苷作用后IL-6、TNF-α水平显著降低，低剂量栀子苷作用后IFN-β水平显著提高，提示栀子苷可能是通过影响TLR3/能诱导产生β干扰素的含TIR结构域的衔接蛋白（TRIF）信号通路，抑制炎症因子IL-6、TNF-α的分泌，提高抗病毒生物活性物质IFN-β合成，实现抗流感病毒作用。

2.3.4 免疫组织化学法（IHC） Zhu等[60]研究鱼腥草多糖（HCP）改善流感病毒感染引起的小鼠肺炎和肠道损伤作用机制，采用IHC检测感染小鼠肺组织中TLR4和核因子κB-P65（P65 NF-κB）的表达及小肠部位IgA和紧密连接蛋白（ZO-1）的表达。结果表明，HCP通过抑制肺炎性细胞因子TLR4-NF-κB的表达，增加肠黏膜IgA和紧密连接蛋白（ZO-1）的表达，改善受损的免疫屏障和肠道物理屏障，减轻流感病毒所致的肺和肠道病理损伤，提高存活率。

2.3.5 间接免疫荧光法 Li等[61]研究板蓝根中成分lariciresinol-4-O-β-D- glucopyranoside抑制甲型流感病毒诱导的促炎反应作用机制，采用间接免疫荧光法检测A549细胞中甲型流感病毒核蛋白复合物的核输出。结果表明，lariciresinol-4-O-β-D-glucopyranoside并不影响病毒核糖核蛋白复合物在感染后期从细胞核输出。徐咏书等[62]研究3种板蓝根制剂对流感病毒NP表达的影响，将板蓝根凝集素作用于转染重组质粒pc DNA3.1（+）/NP 的Hela细胞，用胶体金免疫层析法和间接免疫荧光法检测各组NP表达。结果显示板蓝根凝集素在0.78 mg/ml的实验浓度下NP 不表达，提示板蓝根凝集素可抑制流感病毒NP 基因的表达，阻止NP 的形成，从而发挥抗流感病毒感染的作用。Hsieh等[63]研究清方排毒散（CFPTS）抑制流感病毒释放的作用机制，通过间接免疫荧光法检测HA的转运。结果表明，当用CFPTS处理流感病毒感染的MDCK细胞时，HA的分布呈聚集模式。而在感染病毒的模拟对照细胞中，HA呈弥散分布。而M1在CFPTS处理和未处理的细胞中的分布没有显著差异。因此，CFPTS可能通过影响HA的分布，从而阻断流感病毒的复制。

2.3.6 蛋白质印迹法（Western Blot） Liang等[64]基于TLR3介导的信号通路研究黄芪抗流感病毒的作用机制，采用Western Blot分析受感染的Raw264.7细胞中TLR3、转化生长因子激酶1（TAK1）、TANK结合激酶1（TBK1）、干扰素调节因子3（IRF3）、IFN-β的蛋白表达水平。初步证实，黄芪可能通过调节TLR3-TBK1-IRF3信号通路和TLR3-TAK1-NF-κB信号通路发挥抗病毒作用，蛋白表达的程度受黄芪的浓度影响。提示黄芪抗病毒作用可能是一种多靶点的双向机制，且受药物浓度的影响。Zheng等[65]研究连翘苷A抗甲型流感病毒小鼠肺部视黄酸诱导基因-I 样受体（RLR）信号通路的作用机制，采用Western Blot检测了视黄酸诱导基因蛋白I（RIG-I）、线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）和NF-κB在肺组织中的表达水平。结果表明，连翘苷A组的RIG-I、MAVS和NF-κB水平明显低于病毒对照组，连翘苷A通过下调了RLR信号通路中涉及的蛋白质水平发挥抗流感作用。

2.3.7 分子印迹聚合物 Yang等[66]采用液相色谱柱与奥司他韦（OS）分子印迹聚合物偶联筛选中药抗流感病毒活性成分，以奥司他韦为印迹模板分子，采用OSMIP-LC色谱柱与HPLC系统相结合，鉴定出有亲和力的成分为苦参碱。通过体外细胞病变效应实验和血凝抑制实验验证提取物的体外抗病毒活性，并分析抗病毒活性与其在OS-MIPLC柱上的保留时间之间的相关性。结果表明，苦参碱在OSMIP-LC色谱柱上亲和力与OS相近，OS和苦参碱在体外对H9N2具有减轻CPE和血凝抑制（HI）的活性。由抗病毒活性与色谱保留时间的相关性得出结论，分析物与模板分子之间的色谱行为差异越小，生物活性就越相似。该方法可用于抗流感病毒中药成分的初步筛选。

2.3.8 反转录聚合酶链反应（RT-PCR） Chen等[67]研究基于TLR7途径槲皮素抗H1N1病毒作用机制，采用RT-PCR检测TLR7信号通路TLR7、髓样分化因子88（MyD88）、白介素-1受体相关激酶4（IRAK4）、肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）和NF-kB mRNA的表达。结果表明，与病毒对照组相比，槲皮素和奥司他韦显著降低H1N1诱导的TLR7、MyD88、IRAK4、TRAF6和NF-kB mRNA的过度表达，说明槲皮素和奥司他韦的抗病毒机制与TRL7途径有关。Geng等[68]研究葛根汤抗甲型流感病毒感染机制，采用定量RT-PCR分析病毒上清的病毒基因组拷贝，以确定葛根汤是否影响病毒生物合成的后期阶段。结果表明，感染后10 h，葛根汤治疗组的病毒基因组拷贝数比模型组减少了5倍，说明葛根汤体外抗H1N1病毒活性作用于病毒附着和复制阶段。刘晓婷等[69]采用RTPCR研究黄芩苷对流感病毒H1N1 感染的A549细胞中天冬半胱氨酸蛋白酶（caspase）表达的影响。结果表明，黄芩苷高剂量组（3.96 mg/L）和低剂量组（0.99 mg/L）caspase-3、caspase-8 mRNA 表达均明显下降，caspase-4和蛋白磷酸酶3催化亚基-α-亚型基因（Cn）表达也明显下调。实验中caspase-9表达没有变化，提示黄芩苷作用可能是外源性途径和内质网通路途径的凋亡相关基因表达。

2.3.9 原子力显微镜观察（AFM） AFM可应用于观察病毒感染前后细胞和病毒表面形态的改变、蛋白质、DNA等生物大分子的结构和性质的变化，对病毒感染细胞后的过程进行实时成像，检测细胞动力学参数和细胞运动过程。AFM可从形态学角度研究中药抗流感病毒的活性与作用机制。Hsieh等[70]采用AFM研究麻杏石甘汤抑制流感病毒侵入的机制，结果表明，麻杏石甘汤破坏了病毒的表面结构而阻断了病毒的侵入。

3 结语和展望

随着生物技术的发展，中药抗病毒活性与机制研究已取得了一定的进展。其研究方法涉及蛋白质/核酸、细胞/细胞系、鸡胚、整体动物、人体水平，涉及细胞、免疫、动物等生物学技术和其他新兴分析技术。经临床验证，中药在流感防治中发挥着独特的作用，如在抗病毒的同时发挥抗炎、清热的作用，缩短发热时间，另可通过免疫调节功能，加快机体恢复，此外中药多成分多靶点的特点决定了中药具有广谱抗病毒活性。因此，中药在抗流感病毒防治方面具有良好的研究和开发前景。

中药抗流感病毒活性和机制的深入研究需要多学科间的合作与交流，一方面需要深入的中药物质基础研究，加快中药有效成分的发现、提取、分离等，另一方面需要中药抗流感病毒活性和机制研究方法与中药临床疗效更好地匹配，从而更加深入地阐述中药抗流感病毒活性成分、作用机制，为抗流感病毒中药的发现与安全、有效的临床应用提供科学的依据。