堆型艾美耳球虫外分泌蛋白致细胞损伤研究

王黎霞，黄 芳，张建军，安 健*

(1.北京农业职业学院牧医系；北京 102442；2.北京农学院动物科学技术学院，北京 102206)

原虫的分泌蛋白是虫体在黏附、入侵宿主细胞及在带虫空泡内分泌的，恶性疟原虫的分泌蛋白与整虫的免疫原性存在差异[1]。弓形虫速殖子微线和棒状体从顶端分泌蛋白，而致密颗粒从虫体顶端、侧面及后面分泌蛋白[2]。弓形虫顶端识别宿主细胞后，启动信号，使虫体内的钙离子水平升高，刺激微线分泌相关蛋白[3]，使虫体黏附、入侵宿主细胞[4]，随之棒状体和致密颗粒分泌蛋白形成带虫空泡，构成空泡内微绒毛网状结构成分[5]，促进弓形虫的发育和分化[6]；外分泌蛋白免疫，增强IL-12、IL-10表达，使小鼠腹腔巨噬细胞的活性降低，影响弓形虫的入侵和发育[7]，保护宿主细胞[8]，提高小鼠的保护力[9]；外分泌蛋白也是鉴定感染的重要依据[10-11]。球虫感染后，鸡肠壁弹性丧失，黏膜脱落，黏膜层变薄，内容物中40%～60%的水不被吸收，尽管鸡大量饮水但仍然出现脱水症状，饲料利用率低，粪便变稀不成形，带有大量黏液，鸡粪便带血，甚至出现死亡，证明鸡球虫入侵引起肠道上皮组织功能和器质上的损伤[12]，受细菌、病毒毒素致病性启发，笔者推测球虫的外分泌蛋白的释放对鸡体也会产生损伤，而在艾美耳球虫的研究中未见鸡球虫外分泌蛋白致病性的报道[13]，该试验通过牛肾传代细胞培养E.acervulina，SDS-PAGE和Western Blot鉴定鸡球虫外分泌蛋白，吖啶橙(OA)和碘化丙啶(PI)染色判定该蛋白对细胞的损伤性，初步研究外分泌蛋白的外毒素功能。

1 材料和方法

1.1 材 料

E.acervulina、牛肾传代细胞，北京农学院兽医病理学实验室保存；高糖DMEM、犊牛血清，Gibico公司产品；青霉素、胰酶，Orien公司产品；硫酸链霉素，Topbio公司产品。

1.2 方 法

1.2.1 鸡抗E.acervulina血清制备 纯化球虫的子孢子[14]，制备可溶性蛋白加等体积的弗氏完全佐剂，每只200 μL免疫12日龄无球虫感染的鸡，10 d后二免，二免后10 d，心脏采血，分离抗E.acervulina血清[15]。

1.2.2E.acervulina外分泌蛋白分离 子孢子与细胞共培养2.5 h，使子孢子侵入细胞[16]，换入无血清培养液，每隔12 h收集该时间点前12 h的培养液，并换新培养液，至60 h。离心收集培养液上清[17]，透析浓缩，SDS-PAGE、银染确定外分泌蛋白的大小及分泌时间，抗球虫血清为一抗，HRP-兔抗鸡抗体为二抗，Western Blot确定外分泌蛋白的来源。

1.2.3E.acervulina外分泌蛋白的细胞损伤 牛肾传代细胞接种到6孔板，每孔100万细胞，培养2 h，换入新培养液对照组，保持培养过牛肾传代细胞的培养液对照组，加球虫外分泌蛋白的培养液试验组，继续培养3.5 h，吖啶橙和碘化丙啶染色鉴定细胞膜和核膜的损伤。

2 结 果

2.1 不同培养时间的E. acervulina外分泌蛋白SDS-PAGE分析

12～24 h蛋白的条带最清晰，24～36 h蛋白条带变暗，36～48 h几乎看不到蛋白带，0～12 h和48～60 h看不到外分泌蛋白，表明随着子孢子的发育，E.acervulina外分泌蛋白的量不断减少，见图1。

2.2 E. acervulina外分泌蛋白的Western Blot鉴定

Western Blot检测发现1条清晰的70 kD反应条带与抗E.acervulina血清反应(图2)，说明该蛋白是E.acervulina分泌的。

2.3 E. acervulina外分泌蛋白对牛肾传代细胞的损伤

新培养液对照组、培养过牛肾传代细胞的培养液对照组和加球虫外分泌蛋白的培养液试验组在自然光和吖啶橙染色绿色荧光下未发现差异(图3A、3D、3G和图3B、3E、3H)，说明细胞的遗传物质没有受到损伤；在碘化丙啶染色红色荧光下，新培养液对照组与培养过牛肾传代细胞的培养液对照组比较没有区别，说明培养过牛肾传代细胞的培养液对照组对细胞膜和核膜没有损伤(图3C、3F)，加球虫外分泌蛋白的培养液试验组与新培养液对照组和培养过牛肾传代细胞的培养液对照组三者比较，加球虫外分泌蛋白的培养液试验组的细胞，在细胞形态上未见改变，碘化丙啶染色红色荧光细胞明显增多(图3C、3F、3I)，说明加球虫外分泌蛋白的培养液试验组细胞膜和核膜有损伤。

3 讨 论

为了分离E.acervulina的外分泌蛋白，该试验利用无血清培养，避免培养液中血清蛋白对于试验结果的干扰。每间隔12 h收集该时间点前12 h的培养液，浓缩后SDS-PAGE检测发现，培养60 h内12～24 h的E.acervulina外分泌蛋白最多，Western Blot鉴定该蛋白约70 kD，该外分泌蛋白是子孢子发育成为第一代裂殖子过程中向细胞外分泌的。

巨噬细胞游走抑制因子和天冬氨酰转移酶是E.acervulina外分泌蛋白，前者裂殖子期分泌[18]，后者在子孢子的折光体中[19]，与柔嫩艾美耳球虫有97.4%相似度[20]，入侵时分泌。弓形虫在入侵时分泌很多蛋白，如MIC系列、溶菌酶、醛缩酶、透明质酸酶等[21]，形成带虫空泡[22]，滋养体分泌穿透-增强因子，促进虫体入侵[23]。柔嫩艾美耳球虫子孢子分泌EtSAG10、EtMIC5和TA4[24]。该试验分离得到的外分泌蛋白约70 kD，与已知蛋白大小有明显差异，推测为一种未知蛋白。

弓形虫外分泌蛋白可提高弓形虫的穿透能力和繁殖能力[13]，说明外分泌蛋白对寄生细胞和非寄生细胞都有作用，作为信号而影响其他细胞。球虫寄生的细胞核增大或者减小，细胞质空泡化或呈现不规则，裂殖体成熟，裂殖子溢出细胞时，空泡化不仅在寄生细胞，临近无寄生细胞也发生[25]，预示球虫外分泌蛋白的毒素作用。

吖啶橙能透过完整细胞膜，用于鉴定双链DNA损伤，与双链DNA结合发绿色荧光，与单链核酸结合发红色荧光。碘化丙啶不能透过正常细胞膜和核膜，用于鉴定膜损伤，它与核酸结合发出红色荧光[26]。该试验中，新培养液对照组、培养过牛肾传代细胞的培养液对照组和加球虫外分泌蛋白的培养液试验组在自然光和吖啶橙染色绿色荧光下无差异，说明细胞核酸没有受损；在碘化丙啶染色红色荧光下，新培养液对照组与培养过牛肾传代细胞的培养液对照组比较无差异，说明培养过牛肾传代细胞的培养液对照组细胞膜没有受损，加球虫外分泌蛋白的培养液试验组与新培养液对照组和培养过牛肾传代细胞的培养液对照组三者比较，加球虫外分泌蛋白的培养液试验组的细胞，在细胞形态上改变不是很大，红色荧光细胞明显增多，说明加球虫外分泌蛋白的培养液试验组膜有损伤，它引起细胞膜、核膜的通透性增加。该蛋白可能与第一代裂殖子从细胞溢出、入侵新的宿主细胞有关，同时，该外分泌蛋白具有球虫外毒素的功能，也具备作为球虫免疫的候选抗原的可能性，而该蛋白是否促进裂殖子溢出、入侵新的细胞、是否有免疫原性及在鸡体是否具有同样作用需进一步研究。

该试验通过牛肾传代细胞培养、SDS-PAGE和Western Blot发现一条70 kD的E.acervulina外分泌蛋白，在第一代裂殖体形成中分泌，它引起细胞膜和核膜的通透性增加，说明该E.acervulina外分泌蛋白具有球虫外毒素的功能。