二十五味珊瑚丸质量标准研究

王智森，贺巧娟，刘文全，许 甜，刘东乐

（1.河北省藏药质量工程技术研究中心，河北石家庄 050035；2.西藏藏诺药业股份有限公司，西藏日喀则 857000）

二十五味珊瑚丸[1]以珊瑚、红花为君药，珊瑚安神镇惊，红花活血祛瘀，通经止痛；以珍珠、珍珠母、朱砂、龙骨、磁石、脑石等药为臣药，使本方镇静安神之功效显著，且龙骨、磁石还具平肝潜阳的作用；并佐以广木香、沉香、榜那、诃子、打箭菊等药，行气止痛；以菖蒲、麝香为使药，使本方具有醒神开窍、通络止痛功效，且可引诸药上行头部取得更好的治疗效果；最后辅以甘草调和诸药，且能制约榜那的毒性。本方在镇静安神、活血祛瘀、行气止痛的同时，还加用芝麻、獐牙菜等药健胃、利湿、补益五脏。其作用主要为：安神镇静，活血祛瘀，行气止痛，使血脉畅通，调节人体阴阳，并能祛风除湿，驱散外邪。所以对各种顽固性头痛均有良好的治疗作用。

1 仪器与试药

1.1 仪器液相

LC-20A，日本岛津；超声仪（40k Hz）：QTR20500 震浪；超纯水制备仪：Medium-RS45上海和泰；薄层板：烟台华阳。

1.2 试药

西红花苷I（中国药品生物制品检定所，批号：111588-201704）和西红花苷Ⅱ对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111589-201705）；二十五味珊瑚丸（藏诺生产市售，批号：180802、180803、180801）；甲醇为色谱纯；水为重蒸馏水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

保留《2015版中国药典》[2]二十五味珊瑚丸项下理化与薄层鉴别及含量限定，毒性成分限定，增加以下内容。

2.1 鉴别

（1）取本品，置显微镜下观察：油细胞圆形，直径约50μm，含黄色或黄棕色油状物（藏菖蒲）；以花粉粒或柱头为主：花粉粒无色，具3副合沟；以各种团块为主块为半透明状，形状不一，其上可见细密波状纹理；菊糖团块呈扇形，现放射状线纹理；以纤维为主：韧皮纤维淡黄色，常单个离散，壁厚，木化，有单斜纹孔，切向壁纹孔少见；不规则细小颗粒暗棕红色，有光泽，边缘暗黑色

（2）取本品1g，研细，加丙酮20mL，超声处理20min，滤过，取药渣0.2g，置安瓿中，加稀盐酸试液5mL，封口，置烘箱中，在105℃加热20h，取出，上清液作为供试品溶液。另取珍珠对照药材0.02g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述两种溶液各4μl，分別点于同硅胶G薄层板上，以苯酚-水（7∶2）为展开剂，展开，取出，在105℃加热5~10min，立即喷以0.2%茚三酮乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点。

（3）取本品粉末3g，加乙醚10mL，振摇数分钟，滤过，滤液挥散至1mL，作为供试品溶液。另取丁香酚对照品，加乙醚制成每1mL中含5μL作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录57页）试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-石油醚（60~90℃）（1∶9）为展开剂，展开、取出、晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，电热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的黄棕色斑点。

（4）取本品1g，研细，加石油醚（60~90℃）20mL，超声处理30min，滤过，滤液浓缩至1mL，作为供试品溶液。另取木香对照药材0.05g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（30~60℃）-乙酸乙酯（9∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

（5）取本品2g，研细，加乙醇20mL，超声处理2min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1mL使溶解，作为供试品溶液。诃子0.4g对照药材，同法制成对照药材溶液，另取没食子酸对照品，加乙醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取供试品溶液10μl、对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（6∶4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的黑色斑点。

（6）取本品10g，研细，加乙醇30mL，加热回流30min，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液。另取藏菖蒲对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60~90℃）-乙酸乙酯（4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点。

2.2 含量测定

色谱条件：色谱柱：C18柱（250min*4.6mm，5μm）；流动相为甲醇/水（52∶48），流速为0.8mL/min 检测波长为440nm，柱温为25℃，进样量10μL。理论板数按西红花苷I峰计算应不低于3 500。

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取西红花苷I对照品和西红花苷Ⅱ 对照品适量，分别加乙醇制成每mL含330μg的溶液，即得，作为贮备液。

2.2.2 供试品溶液的制备

取二十五味珊瑚丸0.3g，精密称定，置50mL棕色量瓶中，加入乙醇适量，置水浴中超声处理20min放置室温，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，通过孔径为0.45μm的微孔滤膜，取续滤液，作为供试品。

2.2.3 空白对照溶液的制备

将依照处方比例但不含西红花的空白制剂，按供试品溶液的制备方法制成空白对照样品溶液。

2.2.4 线性关系考察

①精密吸取西红花苷I与Ⅱ对照品贮各液0.5mL、1mL、2mL、2.5mL、4mL、5mL，分别置于5mL容量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，分别进样10ul，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值对进样浓度进行回归处理。结果表明，西红花苷I在33~330μg呈现良好的线性关系。回归方程为A=1 634M-0.908 9，r=0.999 9。

②精密吸取西红花苷Ⅱ 对照品贮备液1mL、2mL、3.2mL、4mL、5mL，分别置于5mL容量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，分别进样10μL，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值对进样浓度进行回归处理，结果表明，西红花苷Ⅱ 在62~310μg，有良好的线性关系，回归方程为A=0.1688M-0.9143，r=0.9998。

2.2.5 重复性试验

照2.2项下，对同一批样品含量测定6次，结果显示二十五味珊瑚丸中西红花苷I和西红花苷Ⅱ的总量的平均含量为0.1307%，西红花苷I和 西 红花苷Ⅱ的 RSD分别为1.06% 和 0.95%，表明该方法的重复性良好。

2.2.6 精密度试验

精密吸取2.2项下供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，重复进样6次，测定西红花苷的色谱峰面积。得出总量峰面积西红花苷I RSD为0.64%和西红花苷Ⅱ的0.51%，表明该方法的精密度良好。

2.2.7 稳定性试验

精密吸取2.2项下供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，按0、1.5、3、6、8、24h间隔进样，测得西红花苷I和西红花苷Ⅱ 的总量，以考察其稳定性。分析得出西红花苷I RSD为1.44%，西红花苷Ⅱ为1.28%。表明供试品溶液在24h内稳定。

2.2.8 阴性对照试验

精密吸取空白样品溶液、供试品溶液和对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，可以看出在空白样品色谱图中，与西红花苷对照品峰对应处无吸收峰。

2.2.9 加样回收试验

取同一批样品6份，每份约0.3g精密称定，置棕色容量瓶中，分别加入0.33mg/mL的西红花苷I和0.13mg/mL西红花苷Ⅱ对照品溶液各1mL，按上述供试品溶液的制各方法制备，依法测定，平均回收率100.05%，RSD 为 1.9%。

2.2.10 样品中西红花苷I和西红花苷Ⅱ的平均含量测定

取3批二十五味珊瑚丸，分别按照2.3.2项下方法制各待测样品。按上述色谱条件分别测定西红花苷I和西红花苷Ⅱ 的总量，并计算西红花苷的平均含量1.31mg/g。

参考中国药典2015版西红花标准与二十五味珍珠丸药典标准，暂定西红花苷I和西红花苷Ⅱ 的总量不少于1.0mg/g。

2.4 讨论

（1）超声时间的选择。根据预实验的结果，供试品制备采用冰浴中分别超声（功率 600W，频率 40kHz）20、25、30、40、50min，依法测定峰面积，结果表明，超声提取20min时的测定值略高，故选择提取时间为 20min。

（2）测定波长的选择。对西红花苷I和西红花苷Ⅱ进行全波长扫描，结果在440nm波长处有最大吸收，故选择440nm作为 测定波长。

3 结语

本文所建立的质量控制方法可准确地进行定性和定量检测，方法可靠，重复性好，可有效控制二十五味珊瑚丸的质量。