基因检测技术应用于溺死诊断的研究进展

刘泉，柯技，王树法

（湖北警官学院，湖北 武汉）

0 引言

判断水中尸体是生前溺死还是死后抛尸是法医学实践中是常见的工作之一。目前，诊断溺死的常用方法是在观察尸体征象的基础上，结合光镜下检验硅藻。传统光镜下检验硅藻存在检材消耗量大、实验过程安全性不高、实验过程损耗高、污染系数高等问题，常被法医工作者诟病。随着分子生物学的发展，基因检测技术相较于光镜下检验硅藻有取材用量少、一次性检验样本多、易于浮游生物种属分类、实验过程安全等优势，为辅助溺死诊断提供了新的研究方向。本文将对相关研究现状作综述，以供同行参考。

1 基因检测技术用于藻类检验

使用基因检测技术检验藻类的某些特有基因片段，不仅可用于硅藻检验，还可用于其他传统方法不易辨认的藻类的检验，甚至可进行溺死地点的推断[1]，从而为辅助溺死诊断提供更多证据。

1.1 检测藻类核基因

目前，藻类核基因中研究最多的是核糖体基因，即编码rRNA 相对应的染色体上的DNA 序列，简称rRNA 基因或rDNA。根据rRNA 的沉降系数，原核生物的rRNA 分为5SrRNA、16SrRNA 和23SrRNA；真核生物的rRNA 分为5SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA 和28SrRNA，它们之间被转录间隔区（ITS）间隔开。

其中，16S rDNA（真核为18S rDNA）片段长度在1500 bp 左右，广泛存在于浮游生物的染色体中，也是通常所说的小核糖体亚基（SSU）[2]，其序列相对保守，有9 个可变区域，可为种属鉴别提供丰富的信息，因此是应用非常广泛的理想检测标记之一。Tie 等人[3]对溺死者组织进行PCR后检测，发现蓝藻的16S rDNA 片段用于溺死诊断的灵敏度明显优于传统的硅藻检验法，为除硅藻外的其他藻类辅助诊断溺死提供了依据。何方刚等人[4-5]研究表明使用PCR 技术扩增浮游生物16SrDNA 第三、第四可变区可用于溺死的定性诊断，使用PCR-DGGE 法扩增检测相应基因片段还可用于溺死地点的推断。为克服不能同时扩增多种与溺死相关藻类，李鹏等人[6]设计出针对多种藻类16S rDNA 片段的特异性引物，发现该方法有较好的应用前景。

由于应用硅藻诊断溺死较为成熟，有许多研究仅关注基因检验技术用于硅藻的检测。周玉倩[7]以硅藻特异的18S rRNA 基因片段为对象，比较了PCR 和PCR-DGGE，发现用PCR 技术扩增硅藻18S rDNA 基因片段诊断溺死的灵敏度和特异性优于传统的硅藻强酸消化法，但PCR-DGGE 得到的条带却不明显，分析可能是因为前期扩增产物量较低的原因。胡蝶等人[8]使用PCR 技术构建了硅藻18S rDNA 克隆文库，为使用硅藻18S rDNA 推断溺死地点提供了更多信息。余政梁等人[9]采用PCR-DHPLC 法检测硅藻的SSU 片段，结果显示该方法检出的硅藻种类明显多于微波消解扫描电镜法，可为溺死诊断和溺死地点的推断提供更多的信息。使用硅藻进行溺死地点的推断还可选用5.8S+ITS2 片段，该片段长度在300～400 bp，有高度的特异性，被认为是区分不同硅藻物种的最可靠的标记[10]。袁文勇等人[11]针对硅藻的5.8S+ITS2 分子标记，使用PCR-CE 法对2 个案例进行研究，发现该遗传标记也可用于溺水及溺水地点的诊断。

1.2 检测藻类叶绿体基因

一般来说，任意两种植物的叶绿体基因同源性不少于30%，因此检测叶绿体基因也可以对藻类进行分类。目前，有用于溺死研究的藻类叶绿体基因有核酮糖-1,5-二磷酸羧化/ 加氧酶人亚基基因（rbcL）、叶绿体23SrDNA 基因的V结构域（UPA）、叶绿素a 脱辅基蛋白基因（EG）和藻黄素-叶绿素a/c 蛋白基因（SK）等。

EG 片段长度在200 bp 左右，SK 片段长度在250 bp 左右，均是广泛分布在各个水域中藻类的叶绿素相关基因。Abe 等人[12]使用PCR 方法扩增EG（EG1、EG2）和SK（SK1 和SK2），发现EG 相较于SK 能检测更多种硅藻，用来溺死诊断的实用价值更大。李小廷等人[13]的研究也证实了该方法的阳性检出率高于硝酸消化法，但也发现常规PCR 技术检测EG 和SK，目前无法进一步进行种属分类用于溺死地点的推断。UPA 片段约长370bp，主要集中在红藻的研究中，研究表明其具有较高的通用性和分辨力，能在种的水平上，把大多数的红藻物种区分开来[14]，具有用于溺死地点推断的潜力。刘向东等人[15]建立了针对硅藻UPA 条形码基因的qPCR 检测方法，对28例溺死和4例非溺死者的肺、肝、肾以及尸体发现地水样进行检测，发现其不仅适用于溺死案件的辅助诊断，而且灵敏度显著高于传统的PCR 技术。rbcL 基因长度约为1400bp，其rbcL-3′端扩增测序效率极高，出现内含子的概率较小，适于硅藻的分类。彭帆等人[16]建立了溺死尸体组织内硅藻rbcL 基因的PCR-CE 检测方法，发现当溺死尸体组织样本中硅藻含量＞10 个/10 g 时，该方法的检出率与微波消解-真空抽滤-自动扫描电镜法（MD-VFAuto SEM）相比无统计学差异；当硅藻含量＜10 个/10 g 时，该方法的检出率显著小于MD-VF-Auto SEM 法。

1.3 检测藻类线粒体基因

藻类线粒体基因一般分为两类：一是与呼吸作用有关的基因，如细胞色素基因、细胞色素氧化酶基因、ATP 合成酶基因及琥珀酸脱氢酶基因等；二是与转录和翻译有关的基因，如包括tRNA、rRNA 等。

目前，藻类中研究较多的是细胞色素C 氧化酶基因（COX-Ⅰ），COX-Ⅰ上有长度为500bp 左右的片段，能进行多种藻类的区分[17-18]。Evans 等人[19]研究发现，该基因可用于硅藻门下22 多个属进行再分类，说明其具有成为硅藻条形码标记的潜力。邓建强等人[20]使用硅藻COX-Ⅰ基因中具有高效特异性的引物KEint2F 和KEintR 进行PCR 检测，发现该法比传统消化镜检具有更高的硅藻检出率，可用于法医学溺死的诊断，但尚无法进行落水地点的推断。

2 基因检测技术用于细菌检验

自然界水域中，还存在各种细菌。由于水中硅藻体积形状差异较大，大小在2～200 μm，部分硅藻不易通过气血屏障进入血液循环，从而降低体内硅藻的检出率。水中细菌大小在0.2～2 μm，普遍比硅藻体积更小，因此被认为有潜力成为溺死诊断的另一个理想标记物[21]。

2.1 检测低盐浓度水域中细菌的相关基因

低盐浓度水域一般为江河湖等淡水水域。由于淡水与海水中的环境不一样，因此这两类水域中生存的细菌种类会有所差别。通过检测溺死者体内不同类型的细菌，可用于溺死的诊断及溺死地点的推断[22-23]。低盐浓度水域中，目前研究的较多的为气单胞菌属相关基因，如气溶素基因（aerA）、促旋酶B 亚单位基因（gyrB）、溶血素基因（hlyA）和16SrRNA基因等。

areA 基因长度约1400 bp，具有种属特异性，基因序列同源性较高[24]。hlyA 基因长度约1900bp，普遍存在于临床和环境中嗜水气单胞菌中，且与areA 基因同源性仅有46.70%[25-26]。16SrRNA 基因约1500bp，是细菌分类及多样性研究的重要分子标记。gyrB 基因长度约2400 bp，广泛存在于各种细菌中，含有可变区和保守区，特别适用于菌株的区别和鉴定。Aoyagi 等人[22]使用巢式PCR 对32 份心血样本中气单胞菌的进行PCR 检验，27 个案件中均扩增出气单胞菌基因组中气单胞菌溶血素基因，认为扩增该基因可用于溺死的诊断。Guy 等人[27]使用qPCR 法扩增20例溺水者体内气单胞菌的aerA、gyrB 基因，结果显示该方法可以用来推断死者是否为淡水中溺死。朱晓琳[28]将气单胞菌的hly A、aer A、16SrRNA 基因与硅藻的多个基因作为共同的研究对象，构建了浮游生物相关基因座的复合扩增检测体系，认为采用该方法相较于单一基因的检测具有特异性强、耗时短、通量大和操作便捷等优点，具有良好地应用前景。麦柏盛等人[29]建立了嗜水气单胞菌gyrB 和16SrRNA 基因PCR 毛细管电泳检测方法，发现该方法检测嗜水气单胞菌gyrB 基因用于诊断淡水溺死灵敏度较高，可作为诊断的辅助性方法；联用16SrRNA 基因可提高该菌的检出率。

2.2 检测高盐浓度水域中细菌的相关基因

高盐浓度水域一般为海水。高盐浓度水域中与溺死有关的基因研究较少，曾报道过有用于溺死诊断的基因有弧菌属的过氧化氢酶基因（katA）、跨膜转录调控蛋白基因（toxR）和溶血素基因（vhh）；还有杆菌属的尿素酶基因（ureC）、超氧化物歧化酶基因（sodB）和荧光素酶A 基因（luxA）等。这些基因普遍存在所述菌属中，片段长度在不同类型的弧菌或杆菌长度有所不同，但均具有一定的保守性，可用于相关菌属的鉴定[30-35]。Uchiyama 等人[23]选取了上述基因用qPCR 技术进行检测，发现淡水水域中死者肺部均检测出气单胞菌，未检出弧菌和杆菌；海水水域中死者肺部均检测出弧菌和杆菌，其中45%死者肺部同时还检测出气单胞菌，推测可能是由于该微生物存在于从河流流向海水的水域中。不仅如此，整个实验血液和内脏器官检测阳性率明显高于常规硅藻检验，可进行死亡地点的判断。

2.3 检测人体环境中细菌的相关基因

在浴池或浴缸内的水由于是被处理过的，各种自然水域中常见的藻类和细菌均相对稀少，从而很难通过传统微生物检验来诊断溺死。目前报道过可用来浴池或浴缸水域中溺死诊断的为果糖基转移酶（FTF）基因。

FTF 主要是位于口腔中唾液链球菌、变异链球菌分泌，在溺水时会随着溺液进入体内。这两种菌属的FTF 基因长度分别约为1400 bp、4000 bp，有两个高度保守区，可用于链球菌的鉴定[36-37]。Suto M 等人[38]通过对唾液链球菌的果糖转移酶（FTF）基因进行PCR 扩增发现在溺死者的血液与内脏器官中均能检测出阳性，而溺液中却检测不出，这为溺死在不含浮游生物的水中的案例提供了有用的参考。

除了可通过基因检测技术检测人体喉部、口腔唾液中的正常菌群外，还有人尝试使用细菌培养的方式检测存在人体中的致病菌，如细菌粪大肠菌、粪链球菌等是否能成为溺死诊断的标志[39]，但相关的基因检测研究还未见。

3 基因检测技术用于人体基因的检测

在溺水过程中，大多数溺水者的肺部会有溺液进入从而引起窒息，这是典型溺死。有的被证实为溺死的案件在肺部未发现溺液，这是非典型溺死。无论哪种过程，人体都会受到损伤，在基因转录或表达水平上发生一定变化，检测某些特有基因的转录和表达水平，可为辅助诊断溺死提供新的视角。信使RNA（mRNA）是由DNA 的一条链作为模板转录而来的、携带遗传信息的能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸，长度一般比对应的基因片段要短，检测相应mRNA 的数量变化，可推断相关人体基因的表达变化。

赵兵等人[40]用qPCR 法检测雄性Wistar 大鼠肺组织AQP-1、AQP-4 mRNA 的表达水平，发溺死组相关基因表达水平明显高于抛尸入水组，认为该基因表达水平的检测可能对生前溺死与死后抛尸的鉴别有一定意义。王莉晓等[41]采集SD 大鼠的肺组织，并使用qPCR 检测CCL2、CCL7 和CCR2 的mRNA 的表达水平，发现淡水溺死组CCL2 和CCL7的mRNA 的表达水平显著高于淡水应激组，但与疾病对照组比较，无统计学差异，认为该方法对溺死的诊断有一定的辅助作用。姜美玲等人[42]用qPCR 法检测大鼠肺组织及右心室血清的IL-1α、IL-1β 和IL-13 的mRNA 的表达情况，发现与空白对照组及心肌梗死组比较，溺死组大鼠右心室血清中的IL-1β、IL-13 的 mRNA 表达显著升高，说明细胞因子IL-1β 及IL-13 的mRNA 的表达与溺死密切相关。

特异性应激基因或损伤修复的转录或表达水平的检测，不仅可辅助诊断溺死，还可为非典型溺死与典型溺死的鉴别诊断提供依据。如尹长玉[43]使用qPCR 技术检测溺死大鼠肺组织内88 种应激相关基因的差异表达，发现非典型溺死组与典型溺死组表达有显著性差异的基因有13 种，这说明非典型溺死与典型溺死两种死亡过程有不同的应激反应机制，其中以CCL2 为代表的CCL 家族基因和IL 家族基因是鉴别非典型溺死的有效生物标志物。

4 总结

从相关研究的基因片段来看，以上基因片段基本都可辅助溺死的定性诊断，灵敏度普遍高于传统的酸消化法。适用于溺死地点推断的基因有藻类的16S rDNA（真核为18S rDNA）、硅藻的5.8S+ITS2 分子标记和细菌的基因。其中16S rDNA（真核为18S rDNA）用于溺死推断需要使用对不同核酸片段区别度更高的基因检测技术，而硅藻的5.8S+ITS2 分子标记仅用法医工作者常用的PCR-CE 法即可；细菌的基因只能用来进行大区域的溺死地点推断，无法进行某单一水域中更具体地点的推断。rbcL、EG 和COX-Ⅰ能对硅藻进行再分类，UPA 能对红藻在种的平面上进行再分类，有用来进行溺死地点推断的潜力。

从相关研究使用的检测技术来看，一般的PCR 法、PCRCE 法、PCR-DHPLC 法、PCR-DGGE 法、qPCR 法和巢式PCR 技术等均可用于溺死的诊断。其中，一般的PCR 法成本最低，其次由于PCR-CE 设备在法医装备中的普及，PCRCE 法使用成本也比较低，是利于基层开展基因检测技术用于溺死定性诊断的两种方法。用于溺死地点推断研究的检测技术中，PCR-DHPLC 法、PCR-DGGE 法和qPCR 法表现得更加适用，推测是由于其分辨率或灵敏度更高的原因，可更好的将不同的目标产物区别开来，利于多种种属的鉴别。除此以外，由于细菌的核酸和RNA 一般为单链，结构不稳定、易降解，因此更合适使用灵敏度高的qPCR 法和巢式PCR 技术。

5 展望

目前，已有科研人员开发了相关浮游生物基因座的复合扩增体系[44-45]，可同时扩增水中多种有利于诊断溺死的微生物的基因，这无疑比单一检测某种微生物的某类基因准确性更高。还有研究人员将PCR 探针用于无创性的尸体检验中[46]，这也大大的扩展了应用范围，对溺死诊断有着重要的实用价值。基因检测技术现已进入三代测序时代，进一步使用该方法检测各种标记物辅助溺死的诊断相较于传统的基因检测方法在大规模检测上无疑更加有优势。因此，增加基因检测速度、提高基因检测精度、扩大基因检测范围是目前基因检测技术用于溺死诊断的研究方向。