铁杆山药多酚氧化酶纯化及酶学性质研究

陈军，蒋鲁圆

(宿州学院 生物与食品工程学院，安徽 宿州 234000)

铁杆山药(Dioscoreaopposita)是一种常见的蔬菜，其营养成分十分丰富，具有很高的食用、保健及药用价值[1-2]，但铁杆山药在贮藏或深加工过程中会有变褐的现象，在山药受到损伤时，暴露出的果肉也会逐渐变黑，会影响其营养品质、口感及其商业价值等。研究认为：当果蔬受到机械损伤时，多酚氧化酶就会从机体中释放出来，与空气中的氧分子接触，通过氧化酚或多酚形成相对应的醌，醌类物质继续发生聚合反应，产生黑色化合物[3]。多酚氧化酶(PPO)广泛存在于果蔬中，果蔬发生褐变主要是由组织中的三种物质引起，既酚类物质、氧气和PPO[4-6]，因此，近年来一些学者对蔬菜中的PPO做了大量的研究。本研究采用匀浆提取法提取铁杆山药PPO，进行单因素实验来检测不同温度、pH、底物、不同浓度的底物、抑制剂对PPO的影响以及PPO的热稳定性，进而分析铁杆山药PPO的酶学性质，为控制铁杆山药变褐提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料：铁杆山药(市售)，邻苯二酚(儿茶酚)、L-络氨酸、Vc、柠檬酸、EDTA、NaCl、焦性没食子酸，均为分析纯。

仪器：冷冻高速离心机(上海元析仪器有限公司)、紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司)、数显恒温水浴锅(江苏金坛国胜实验仪器厂)。

1.2 实验方法

1.2.1 铁杆山药PPO的粗提取 采用匀浆浸取法[7]，将0.2 mol/L的NaH2PO4与0.2 mol/L的Na2HPO4·12H2O按一定比例混合，配制磷酸盐缓冲溶液，pH为6.8，洗净铁杆山药，去皮，取2.0 g预冷的铁杆山药和15 mL磷酸盐缓冲液于研钵中，研磨后置于4 ℃冰箱静置10 min，取出上清液转至10 mL离心管中，用高速冷冻离心机以4 ℃、5000 r/min离心20 min，将离心所得上清液转移至离心管中，收集的上清液即为铁杆山药PPO粗酶液，将其储存至4 ℃冰箱中备用。

1.2.2 铁杆山药PPO的酶活性测定 参照段勇[8]的实验方案，取4只试管，使用移液枪向试管中分别加入2 mL的磷酸缓冲液(pH=6.8)、1 mL的0.04 mol/L儿茶酚，以3只试管为平行试验，另外一只试管为空白对照组，平行实验组加入0.5 mL的新鲜酶液，空白对照组加入0.5 mL的蒸馏水。试管中加入酶液后，摇匀振荡，在波长为420 nm的紫外分光光光度计中测得吸光值，每30 s记一次吸光值，共5 min。

1.2.3 铁杆山药PPO的纯化 采用硫酸铵分级沉淀法[9]，将(NH4)2SO4加入PPO粗酶液至30%的饱和度，5000 r/min的条件下的离心机离心20 min，弃上清液，向沉淀中加入不同pH值的0.05 mol/L磷酸盐缓冲溶液，并将(NH4)2SO4缓慢加入PPO粗酶液中使其饱和度达到50%，再次在高速冷冻离心机中4℃以5000 r/min离心20 min，根据溶液的体积加入(NH4)2SO4使其饱和度达到80%,再按上述步骤处理。

1.2.4 不同底物对铁杆山药PPO活性的影响 将儿茶酚、L-络氨酸和焦性没食子酸3种不同底物均配制成浓度为0.04 mol/L的溶液。取3支试管，向每支试管中加入2 mL的pH=6.8磷酸盐缓冲溶液和0.5 mL的新鲜酶液，分别加入1 mL 的0.04 mol/L浓度的底物，于420 nm波长处测得吸光值，每组底物测量三次，取平均值，计算得到PPO酶活。

1.2.5 不同浓度儿茶酚对铁杆山药PPO活性的影响 分别配制不同浓度的儿茶酚0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09 mol/L，在试管中加入2 mL(pH=6.8)的磷酸缓冲液、1 mL 不同浓度的儿茶酚和0.5 mL的新鲜酶液，空白对照组加入0.5 mL的双蒸水进行对照，在相同环境下，每组底物测量三次，在波长为420 nm处测得吸光值，取平均值，计算得到PPO酶活。

1.2.6 不同pH对铁杆山药PPO活性的影响 将0.2 mol/L的NaH2PO4和0.2 mol/L的Na2HPO4·12H2O混合，配制成pH分别为5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7的磷酸缓冲液，在试管中分别加入不同pH的磷酸缓冲液2 mL、1 mL 0.04 mol/L的儿茶酚和0.5 mL的新鲜酶液，空白对照组加入0.5 mL的双蒸水进行对照，在波长为420 nm处测得吸光值，得到PPO酶活。

1.2.7 不同温度对铁杆山药PPO活性的影响 将加有2mL的 pH=6.8的磷酸缓冲液和1mL的 0.04 mol/L的儿茶酚的试管，分别放入20、25、30、35、40、45、50、55、60、65℃中保温5 min，再加入0.5 mL酶液，空白对照组加入0.5 mL的双蒸水，在相同环境下，每组底物测量三次在波长为420 nm处测得吸光值，计算得到PPO酶活。

1.2.8 不同抑制剂对铁杆山药PPO活性的影响 在加有2 mL的pH=6.8磷酸缓冲液和1 mL的0.04 mol/L儿茶酚试管中，分别加入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%和1.8%的不同抑制剂柠檬酸、Vc、NaCl和EDTA各0.5 mL，再加入0.5 mL的新鲜酶液，空白对照组加入0.5 mL的双蒸水进行对照，在波长为420 nm处测得吸光值，计算得到PPO酶活。

1.2.9 铁杆山药PPO热稳定性 将新鲜酶液放入100 ℃中，分别保存5、10、15、20、25、30、35 s，取1 mL酶液放入装有2 mL的pH=6.8磷酸缓冲液和1 mL 的0.04 mol/L儿茶酚试管中，空白对照组加入0.5 mL的双蒸水进行对照，在相同环境下，每组底物测量三次，在波长为420 nm处测得吸光值，取平均值，计算得到PPO酶活。

2 结果与分析

2.1 不同底物对铁杆山药PPO活性的影响

图1 不同底物对铁杆山药PPO活性的影响 图2 不同浓度的儿茶酚对铁杆山药PPO活性的影

由图1可知，相同浓度的底物，其中儿茶酚对铁杆山药PPO的影响最大，其反应过程中在420 nm处吸光值远远大于L-络氨酸和焦性没食子酸，并且随着儿茶酚浓度的增加，PPO酶活力越强，在儿茶酚浓度为0.07 mol/L时，PPO酶活力达到最大；当底物浓度在0.03～0.05 mol/L之间时L-络氨酸与焦性没食子酸对铁杆山药PPO的影响相似，几乎相同，当底物浓度低于0.03 mol/L和高于0.05 mol/L时，L-络氨酸的影响稍高于焦性没食子酸的影响。由此表明，铁杆山药的最适底物为儿茶酚，此结果也与刘莹、赵喜亭[10]等人的实验结果保持一致。

2.2 不同浓度的儿茶酚对铁杆山药PPO活性的影响

由图2可知，随着儿茶酚浓度增加，PPO活性先增大后减小。儿茶酚浓度在0.01～0.07 mol/L时，随着底物浓度的增大，PPO活性逐渐增大；当儿茶酚的浓度在0.07～0.09 mol/L时，随着底物浓度的增大，PPO的活性逐渐减低。由此表明，铁杆山药的PPO的最适儿茶酚底物浓度为0.07 mol/L。

2.3 不同pH对铁杆山药PPO活性的影响

由图3可知，pH为5.8～6.0时，铁杆山药PPO的活性在不断增加，当pH=6.0时，酶活性最强。PPO中含有Cu2+，PPO在较酸性环境中会使Cu2+分解，进而使PPO失活，当pH>6.0时，其酶活性逐渐下降，其原因是偏中性环境中，Cu2+会生成Cu(OH)2沉淀，而使PPO活性下降。由此表明，铁杆山药PPO的最适pH为6.0。

2.4 不同温度对铁杆山药PPO活性的影响

由图4可知，在20℃～30℃时，铁杆山药PPO的酶活性逐渐增强，在30℃时，铁杆山药PPO活性达到最大，随着温度的继续升高，铁杆山药PPO的活性又逐渐降低。由此表明，铁杆山药PPO的最适反应温度为30℃。

图3 不同pH对铁杆山药PPO活性的影响 图4 不同温度对铁杆山药PPO活性的影响

2.5 不同抑制剂对铁杆山药PPO活性的影响

由图5可知，随着抑制剂浓度的增加PPO活性逐渐降低。不同抑制剂对铁杆山药PPO活性的抑制效果有一定差异，Vc的抑制效果最好，EDTA的抑制效果次之，柠檬酸和NaCI的抑制效果相对较差。由于Vc是一种有机酸，具有一定的还原作用，能够将Cu2+转化成Cu+，有效地抑制了PPO的活性。

2.6 铁杆山药PPO活性的热稳定性

由图6可知，铁杆山药PPO在100℃中加热，伴随着时间的延长，其吸光值不断下降，使得铁杆山药PPO酶分子遭到破坏，酶活性持续降低，加热30 s之后，PPO的酶活性基本失活。

图5 不同抑制剂对铁杆山药PPO活性的影响 图6 铁杆山药PPO活性的热稳定性

3 结论

铁杆山药是一种较受欢迎的蔬菜，具有很高的营养价值，对其PPO特性研究具有很高的应用价值。通过研究得出，铁杆山药PPO最适底物为儿茶酚，其浓度为0.07 mol/L，最适温度为30℃，最适pH为6.0，Vc对铁杆山药PPO活性的抑制效果最为显著，铁杆山药PPO在100℃中加热30 s后，其酶活性基本丧失。