日粮中添加NCG对妊娠前期鄂尔多斯细毛羊血液、尿囊液和羊水中氨基酸浓度的影响

吴宝升，张崇志△，孙海洲*，桑 丹*，李胜利，张春华，金 鹿，斯登丹巴，谷 英

(1. 内蒙古自治区农牧业科学院 内蒙古自治区草食动物营养科学重点实验室 内蒙古 呼和浩特 010031；2. 鄂尔多斯市农牧业科学研究院，内蒙古 鄂尔多斯 017000)

功能性氨基酸在动物机体具有合成蛋白质及多种生物活性物质的生理功能，尤其在母畜妊娠期阶段扮演着重要的角色。功能性氨基酸家族主要包括精氨酸(Arg)、谷氨酰胺、谷氨酸、支链氨酸、色氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、脯氨酸、瓜氨酸、组氨酸、甲硫氨酸和牛磺酸等[1-2]。N-氨甲酰谷氨酸(NCG)作为内源Arg生成激活剂，具有内源性Arg合成的限制酶激活剂和多种生物活性物质的功能。NCG能够通过参与二氢吡咯-5-羧酸合成酶和氨甲酰磷酸合成酶I的激活，促使谷氨酰胺合成瓜氨酸，进而促进内源性精氨酸(Arg)的合成[3]。谷氨酰胺和Arg能够通过AMPK、cGMP和mTOR等信号通路来调节底物氧化和蛋白质合成[4]，在妊娠前期母畜胚胎和胎盘的生长发育过程中具有重要作用[5]。

目前研究表明，动物繁殖期日粮中添加NCG不仅促进内源Arg合成、调控动物生长发育及营养物质的合理分配，也能有效降低胚胎损失、促进胎儿发育及提高母畜繁殖率[4，6-8]。Liu等[9]研究发现，母猪妊娠早期补充0.4%NCG可以促进黄体形成，降低胚胎死亡率；妊娠后期日粮中补充0.08%的NCG相比对照组分别提高窝产活仔数11.75%和窝产活仔总重量13.23%，日粮中添加0.08%NCG和1%Arg都显著提高血浆Arg浓度。Kwon等[10]研究发现，在妊娠早-中期阶段静脉灌注Arg提高母羊子宫液和尿囊液中Arg和瓜氨酸含量，改善胚胎存活率。Lassal等[11]研究多胎母羊灌注Arg试验发现，出生羔羊死亡率降低23%，羔羊存活率增加59%，四胞胎出生体重提高23%。

目前，国内外关于NCG对母羊妊娠前期营养调控方面的研究鲜有报道。因此，本试验在日粮中添加不同剂量的NCG，研究NCG对妊娠前期鄂尔多斯细毛羊血液、尿囊液和羊水中氨基酸浓度的影响，为鄂尔多斯细毛羊妊娠期繁殖性能的提高提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选择体况良好，2～3周岁，平均体重为(50.62±0.52)kg的受孕鄂尔多斯细毛羊母羊40只随机分为3组，各组试验母羊体重经F检验差异均不显著(P>0.05)。

1.2 试验期

本试验于鄂尔多斯细毛羊妊娠期开始至妊娠期第90 d结束，整个试验期90 d。

1.3 试验动物日粮组成及营养水平的设定

试验母羊基础日粮配制参考NRC(2007)：按照母羊妊娠前期饲养标准设计配方，日粮的营养组成及营养水平见表1。

表1 日粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of diets(air-dry basis)

1.4 试验动物的饲养管理

饲喂NRC(2007)推荐的基础日粮(满足妊娠双胎母羊需要量为26.2 g/kg体重)，再与不同浓度NCG进行混匀，每只母羊单独套袋饲喂，准确记录供给饲喂量和剩料量。40只试验母羊随机分为3组，NCG1组饲喂基础日粮+0.30 g NCG/d(n=13),NCG2组饲喂基础日粮+0.40 g NCG/d(n=13)，对照组饲喂基础日粮(n=14)。每日上午8:00和下午17:00饲喂两次，自由饮水。NCG添加剂量参考本团队前期的试验结果。每天清扫羊圈、清除粪便、清洗饮水池，确保周围环境的清洁。

1.5 取样方法

妊娠期第0 d、45 d和90 d，对试验母羊进行称重，根据体重变化及时调整母羊的日粮供给量。妊娠期第45 d和90 d，分别每组3只母羊进行屠宰，立即取出子宫、剥离尿囊绒膜和羊膜，用50 mL注射器抽取尿囊液和羊水并测量体积，记录胎儿体重。妊娠期第45 d和90 d每组6只试验母羊颈静脉采血、妊娠期90 d胎儿心脏采血，使用含肝素钠的离心管分别收集母羊和胎儿血液10 mL，3 500 rpm离心15 min，取上清液并-20 ℃冷冻保存待测。

1.6 氨基酸的测定

采用高效液相色谱法测定氨基酸浓度，由北京普瑞华盛生物科技有限公司通过高效液相色谱-四级杆离子阱串联质谱仪(HPLC-MS/MS API3200 Q-TRAP)检测血浆游离氨基酸浓度。

1.7 数据分析

所有数据采用SAS9.0一般线性模型统计分析，Duncan法进行多重比较，结果以平均值±SEM表示。

2 结果与分析

2.1 日粮添加NCG对妊娠前期母羊体重、胎儿体重、尿囊液量及羊水量的影响

由表2可知，妊娠期第0 d和45 d，对照组、NCG1组和NCG2组母羊体重没有显著差异(P>0.05)；妊娠期第90 d，NCG2组母羊体重最高，达到61 kg，但与对照组和NCG1组母羊体重差异不显著(P>0.05)。妊娠期第45 d，对照组、NCG1组和NCG2组胎儿体重没有显著差异(P>0.05)；妊娠期第90 d，NCG1组胎儿体重最高，达到537.50 g，但与对照组和NCG2组胎儿体重差异不显著(P>0.05)。妊娠期第45 d和90 d，对照组、NCG1组和NCG2组母羊尿囊液和羊水含量均呈现逐渐递增的趋势，但其差异均不显著(P>0.05)。

表2 妊娠前期母羊体重、胎儿体重、尿囊液量及羊水量变化情况 Table 2 Changes of maternal body weight, fetal weight, allantoic fluid and amniotic fluid in pre-pregnancy

2.2 日粮添加NCG对妊娠前期母羊血浆氨基酸浓度的影响

由表3可知，妊娠期第45天，NCG2组母羊血浆中瓜氨酸和鸟氨酸浓度显著高于NCG1组(P<0.05)、极显著高于对照组(P<0.01)；对照组、

表3 妊娠期第45天和90天母羊血浆中氨基酸浓度的变化Table 3 Changes of amino acids concentrations in maternal plasma at 45 and 90 days of pregnancy μmol/L

NCG1组和NCG2组母羊血浆中脯氨酸、天冬酰胺、色氨酸、β-丙氨酸和亮氨酸浓度表现逐渐降低的趋势，但差异不显著(P>0.05)，缬氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、Arg和牛黄氨酸浓度表现逐渐升高的趋势，但差异不显著(P>0.05)。妊娠期第90天，对照组母羊血浆中甘氨酸和甲硫氨酸浓度显著高于NCG1组(P<0.05)，NCG2组丝氨酸和Arg浓度显著高于对照组(P<0.05)，NCG1组和NCG2组谷氨酸浓度显著高于对照组(P<0.05)；对照组、NCG1组和NCG2组母羊血浆中丙氨酸和天冬酰胺浓度表现逐渐降低的趋势，但差异不显著(P>0.05)，半胱氨酸和β-丙氨酸浓度表现逐渐升高的趋势，但差异不显著(P>0.05)。

2.3 日粮添加NCG对妊娠前期母羊尿囊液中氨基酸浓度的影响

由表4可知，妊娠期第45 d，NCG1组和NCG2组母羊尿囊液中谷氨酰胺浓度显著高于对照组(P<0.05)，对照组、NCG1组和NCG2组母羊尿囊液中甘氨酸、丙氨酸、牛黄氨酸和β-丙氨酸浓度表现逐渐降低的趋势，但差异不显著(P>0.05)，天冬酰胺、谷氨酸、色氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸和亮氨酸浓度表现逐渐升高的趋势，但差异不显著(P>0.05)。妊娠期第90 d，对照组母羊尿囊液中甲硫氨酸浓度显著高于NCG2组(P<0.05)，对照组组氨酸浓度显著高于NCG1组和NCG2组(P<0.05)，NCG2组和NCG1组Arg浓度显著高于对照组(P<0.05)，NCG1组鸟氨酸浓度显著高于NCG2组(P<0.05)和对照组(P<0.01)，NCG1组苏氨酸和半胱氨酸浓度显著高于对照组(P<0.05)；对照组、NCG1组和NCG2组母羊尿囊液中甘氨酸、丝氨酸、色氨酸和赖氨酸浓度表现逐渐降低的趋势，但差异不显著(P>0.05)，异亮氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸和β-丙氨酸浓度表现逐渐升高的趋势，但差异不显著(P>0.05)。

表4 妊娠期第45和90天母羊尿囊液中氨基酸浓度的变化Table 4 Changes of amino acids concentrations in maternal allantoic fluid at 45 and 90 days of pregnancy μmol/L

2.4 日粮添加NCG对妊娠前期母羊羊水中氨基酸浓度的影响

由表5可知，妊娠期第45 d，对照组母羊羊水中丝氨酸浓度显著高于NCG1组(P<0.05)；对照组、NCG1组和NCG2组母羊羊水中脯氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、Arg、色氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和β-丙氨酸浓度表现逐渐升高的趋势，但差异不显著(P>0.05)。妊娠期第90 d，NCG2组母羊羊水中谷氨酰胺、Arg和瓜氨酸浓度显著高于对照组(P<0.05)，对照组牛黄氨酸浓度显著高于NCG1组(P<0.05)，NCG2组和NCG1组鸟氨酸浓度显著高于对照组(P<0.05)；对照组、NCG1组和NCG2组母羊羊水中半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、组氨酸和本丙氨酸浓度表现逐渐降低的趋势，但差异不显著(P>0.05)，脯氨酸和缬氨酸浓度表现逐渐升高的趋势，但差异不显著(P>0.05)。

表5 妊娠期第45和90天母羊羊水中氨基酸浓度的变化Table 5 Changes of amino acids concentrations in maternal amniotic fluid at 45 and 90 days of pregnancy μmol/L

2.5 日粮添加NCG对妊娠期羊胎儿血浆中氨基酸浓度的影响

由表6可知，妊娠期第90 d，对照组胎儿血浆中甘氨酸和甲硫氨酸浓度极显著高于NCG1组和NCG2组(P<0.01)，NCG2组和NCG1组苏氨酸和鸟氨酸浓度极显著高于对照组(P<0.01)，对照组半胱氨酸和色氨酸浓度显著高于NCG1组(P<0.05)，NCG1组丙氨酸浓度显著高于对照组(P<0.05)，NCG2组和NCG1组Arg浓度显著高于对照组(P<0.05)，NCG2组瓜氨酸浓度显著高于对照组(P<0.05)，对照组牛黄氨酸浓度显著高于NCG2组(P<0.05)、极显著高于NCG1组(P<0.01)。

表6 妊娠期第90天胎儿血浆中氨基酸浓度的变化Table 6 Changes of amino acids concentrations in fetal plasma at 90 days of pregnancy μmol/L

3 讨 论

3.1 日粮添加NCG对妊娠前期母羊体重、胎儿体重、尿囊液量及羊水量的影响

母体子宫内胎儿的生长发育是一个复杂的生物学过程，其过程中受到营养、遗传、生理、母体成熟和环境等综合因素影响的作用[12-13]。母体的自然分娩和新生儿的正常生存需要有一个“最佳”的母体配种体重和胎儿初生体重[14]。胎儿初生体重在“最佳”范围之外出现偏差或者波动都有可能对胎儿生长发育有明显的影响，使胎儿的体尺和组织器官生长发育出现异常变化，可能对后代的生理和代谢造成永久性的改变，甚至影响新生儿的生存能力，同时改变后代的健康[15-17]。研究发现，日粮中添加NCG对母畜妊娠期的胚胎、胎盘和胎儿生长发育过程中具有重要作用[18-19]。刘俊锋等[20]研究发现，妊娠早期胎儿的体重与尿囊液及和羊水量以及生化参数紧密相关，尿囊液与羊水量及化学成分的变化可以反映胎儿-母体间营养素转运和胎儿生长发育的状况[21]。母畜体内尿囊液和羊水中的生化成分是胎儿生命活动的物质基础，其含量或活性的变化可反映胎儿组织细胞通透性与机体新陈代谢状况[22]。羊水中的氨基酸(AA)主要源于妊娠前期母体胎盘和胎儿之间的物质循环，尿囊液中的AA主要来自于母体和胎儿的分泌物[23]。胎儿能过通过吞咽羊水获得自身生长发育所需要的AA和其他生物分子[24]，这些物质部分来自于胎盘，因此羊膜腔内的羊水量及成分受到胎儿和胎盘等因素的影响。在本试验中，妊娠前期(0～90 d)日粮添加不同剂量的NCG对鄂尔多斯细毛羊母羊体重和胎儿体重没有显著的影响(P>0.05)，而日粮添加不同剂量的NCG在妊娠期45 d和90 d都有增加尿囊液和羊水含量的趋势(P>0.05)， 这可能由于日粮中NCG的添加改变了尿囊液和羊水中的物质代谢反应[20]，尿囊液和羊水量的增加可能对鄂尔多斯细毛羊胎儿-母体间营养素转运及胎儿的生长发育起到重要作用。

3.2 日粮添加NCG对妊娠前期母羊血浆、尿囊液、羊水及胎儿血浆中氨基酸浓度的影响

氨基酸在动物妊娠过程中对于胎盘和胎儿的发育具有重要的代谢作用，由AA合成的蛋白质是胎儿组织器官的主要组成部分，母体血液AA能够通过胎盘运输到胎儿体内以供给胎儿生长发育[25]，因此妊娠期母体蛋白质的补充是改善胎儿生长发育的有效措施[19]。Arg作为人体和动物组织中蛋白质最丰富的载体之一，是机体内合成蛋白质、一氧化氮(NO)、尿素、多胺、鸟氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺和肌丁胺等多种物质的直接或间接前体物质[26]。Arg也可以通过其代谢物调控下丘脑、肾上腺和胰腺中激素的分泌、胎盘的营养运输及组织中蛋白质的合成等。NCG作为Arg的合成限速酶有效激活剂，可以增强内源性Arg的合成。研究发现，母体补充Arg会增加子宫-胎盘血流量，有效促进胎儿生长发育[15，27]。Arg是哺乳动物妊娠期必需的功能性氨基酸，也是合成动物机体内多种生物活性分子的前体物质[4，28]，在妊娠期母羊日粮中添加功能性氨基酸对胎儿和胎盘生长发育过程中至关重要。Thureen等[29]研究发现，母体血浆Arg浓度通过子宫-胎盘枢纽功能的脐带和血管转运至胎儿体内，提高胎儿体内的Arg浓度，促进胎儿器官和组织的生长发育。NO是血管舒张和信号分子，多胺是DNA和蛋白合成的关键调控者，作为NO和多胺合成的前体物，Arg能够能够调控胎盘的营养运输，参与组织中蛋白质合成等多种生理过程，对胎盘和胎儿的发育具有重要调节作用[16，19，30]。

本试验结果发现，妊娠前期(0～90 d)日粮添加不同剂量的NCG显著增加母羊血浆、尿囊液、羊水及胎儿血浆中Arg、瓜氨酸和鸟氨酸的浓度(P<0.05)，母羊血浆和胎儿血浆中谷氨酸的浓度随着NCG剂量的增加而增加，母羊尿囊液和羊水中谷氨酰胺的浓度显著增加(P<0.05)。日粮中添加NCG不仅能够提高母羊血浆中Arg家族的浓度，还能增加尿囊液、羊水和胎儿血液中Arg家族的浓度，提高机体内源性Arg浓度，促进机体合成肌酸、多胺、NO和激素等重要的生物活性物质[31]。这些生物活性物质能够提高母羊卵子质量和排卵数、受精卵的定植和胚胎在子宫内附植，促进胎盘生成及孕体的生长发育。有研究发现，Arg使母畜血浆、羊水和尿囊液中精氨酸的浓度显著提高，这与本试验研究结果相一致[20]。尿囊液和羊水中Arg浓度的增加与妊娠前期胎盘合成最大量的NO和多胺有关，此时胎盘正在快速生长，Arg在母畜体内经NOS分解代谢为NO后，子宫对Arg以及NO进行充分吸收和合成，以满足胚胎生长发育的需要[13，32-33]。日粮中添加NCG通过提高母羊自身和胎儿体内Arg、瓜氨酸和鸟氨酸浓度，进而提高胰岛素、生长激素、胰岛素样-1、甲状腺素等的分泌，胰岛素和生长激素能够调节肌肉、脂肪和肝脏组织中的糖酵解、TCA循环、脂肪酸氧化以及糖异生和氨基酸代谢途径的相互转换和合成[4，15]。在若干个代谢通路的协同作用下，妊娠期第10～15天母羊子宫腔内Arg浓度将增加8倍[34-36]，子宫腔内的Arg会增加生物活性分子NO和多胺含量，能够诱导母羊孕体滋养外胚层中的IFNT使胚胎从球形状改变为丝状结构。体内的Arg在Arg脱羧酶(ADC)作用下分解为胍丁胺，胍丁胺在胍丁胺酶(AGAMAT)的作用下形成腐胺，胍丁胺和腐胺是直接影响子宫和孕体发育的关键活性物质。在Arg代谢途径中，ODC1作为限制性酶抑制Arg的转变多胺途径，SLC7A1是孕体滋养外胚层最主要的转运Arg的载体，NOS3是母羊孕体滋养外胚层合成NO和瓜氨酸的关键NOS异构酶[37]。鸟氨酸是Arg在Arg酶的作用下的代谢产物，作为尿素循环的一部分与尿素形成有关。增加的Arg浓度促进鸟氨酸浓度升高，在鸟氨酸脱羧酶作用下形成多胺，从而进入尿素循环促进氨解毒作用。妊娠前期日粮添加不同剂量的NCG显著增加母羊尿囊液和胎儿血浆中苏氨酸的浓度(P<0.05)，母羊血浆和羊水中苏氨酸的浓度也不同程度表现出增加的趋势(P>0.05)。苏氨酸属于生糖氨基酸家族的成员，可以代谢转变成丙酮酸、a-酮戊二酸和草酰乙酸，通过羧酸变成葡萄糖和糖原。这些AA浓度的增加能够促进新生羔羊糖代谢，从而提高抵抗饥饿和寒冷等外界环境的能力，有效维持体温和提高生存能力。

4 结 论

本试验条件下，妊娠前期日粮中添加NCG有效提高母羊血浆、尿囊液、羊水和胎儿血浆中Arg家族氨基酸的浓度，对保障胎儿早期程序化的健康生长发挥重要作用。