土壤原位酶谱技术研究现状和趋势的文献计量分析

范利超，颜鹏，韩文炎

(中国农业科学院 茶叶研究所， 浙江 杭州 310008)

土壤原位酶谱技术(soil zymography)是一种新兴的二维空间土壤酶活性可视化及定量化的技术，由于其无破坏且可重复测量的特征，近年来在农业和生态学领域得到了快速发展[1]。土壤原位酶谱技术是底物诱导型酶活性(substrate-dependent enzyme activity)的可视化技术，其原理是利用土壤中的活性酶氧化分解由荧光染料与相应底物合成的特定荧光底物，从而产生荧光信号在尼龙膜上显影的过程[2]。合成的荧光底物最初位于膜上，被荧光底物浸泡饱和的尼龙膜与土壤表面紧密贴合后，合成的荧光底物在遇到土壤表面的特定酶时被分解，从而激活荧光[2]。土壤原位酶谱技术的结果是由在紫外灯下显影并利用相机通过合适的设备设定后拍摄的二维图像，被称为原位酶谱(zymogram)[2]。原位酶谱图像可以进一步定量为单位面积和单位时间的酶活性。Baldrian等[3]第一次尝试进行了土壤酶活性的可视化，即将合成的荧光标记底物溶解在琼脂糖溶液中，然后把溶液直接倒洒在土壤样品表面而不是利用膜作为载体。Spohn等[1]第一次采用尼龙膜作为合成荧光标记底物的载体，应用于土壤表面实现了土壤酶活性的二维显影。用于土壤酶谱的荧光染料底物有多种[2]，例如7-氨基-4-甲基香豆素(7-amino-4-methyl coumarin，AMC)和4-甲基伞形酮(4-methylumbelliferone，MUF)等。目前，土壤酶谱可视化的酶共有十种[2]，分别为α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)、β-纤维二糖苷酶(β-cellobiosidase)、木聚糖酶(xylanase)、磷酸酶(phosphatase)、亮氨酸氨基肽酶(leucine-aminopeptidase)、酪氨酸氨基肽酶(tyrosine-aminopeptidase)、几丁质酶(chitinase)、壳三糖苷酶(chitotriosidase)和过氧化物酶(peroxidase)。

土壤原位酶谱技术被发展应用于农业和生态学的多个方面[4-5]：(1)在田间和实验室条件下比较不同植物类型之间的酶活性分布特征。例如，Razavi等[6]比较了在气候室根箱(rhizobox)种植条件下玉米(Zeamays)和扁豆(Lensculinaris)的土壤酶活性的空间分布，其结果表明扁豆根部的酶活性是均匀分布的，而玉米根尖处酶活性较高，从根尖向外酶活性逐渐降低直到相对稳定(图1)。(2)环境因素对土壤酶活性的影响，例如温度[7]、水分[8-9]、营养元素[10]和重金属污染[11]等。(3)根形态对土壤酶活性的影响，例如根毛及根径大小[12-13]。(4)土壤酶活性在不同土壤层面的差异，例如植物根际(rhizosphere)[14-15]、土壤生物孔洞(biopores)[16]和植物残体形成的土孔环境(detritusphere)[17-18]。(5)鉴定植物根际范围大小和土壤微生物活动的“热点”区域[4,19]。但是，土壤原位酶谱技术反映的是土壤剖面或根箱表层土壤的酶活性而不是代表整个土体，因此，土壤原位酶谱技术并不能取代经典的酶活性测定方法[3]。

A和B分别为扁豆和玉米根箱土壤表层的酶谱，其中每个图中a～d分别为亮氨酸氨基肽酶、磷酸酶、β-葡萄糖苷酶及纤维二糖苷酶。C和D分别为扁豆和玉米植株根尖区域的酶活性变化特征，详情分析可见参考文献[6]。图片使用已获参考文献[6]的作者授权。图1 土壤原位酶谱的实例

文献计量分析是一种基于数学统计的定量分析方法，该方法使用文献来客观有效地评估学科领域的研究热点和研究趋势[20-21]。当前，许多学者已经使用这种方法探索了农业、经济、政治、 生态、管理等诸多学科研究的前沿和热点[22-23]。为此，本研究拟基于Web of Science收录数据，对当前土壤原位酶谱技术研究进行文献计量分析，以期为相关研究提供参考。

1 数据来源与研究方法

本文用于文献计量分析的数据来源于科睿唯安的 Web of Science核心合集数据库(Core Collection)。以soil-zymography为文献检索的主题词(TS)，则可以检索出以学术术语“soil-zymography”为主题但排除其他zymography相关的论文。对所有年份 (All years) 和文献类型为Article和Review的文献进行检索。本文文献数据集的检索时间为2020年4月18日。利用Web of Science 自带的分析工具、VOSviewer[24]和HistCite软件对土壤原位酶谱研究领域的发文数量和被引次数的变化趋势、主要发文国家和机构以及作者之间的合作网络关系、研究领域的学科分布、关键词及研究热点等进行分析。其中合并同义的关键词，例如soil zymography与zymography，enzyme activity与enzyme activities等。

2 结果与分析

2.1 发文数量和被引次数

发文数量可反映该领域的发展速度和发展进程，可表征研究者对本领域的关注程度[22]。通过检索，得到的土壤原位酶谱领域的文献数量为29篇(图2)。总文献数量较低说明土壤原位酶谱技术仍然处于发展的前期阶段。第一篇以“soil-zymography”为特定主题的文献出现在2013年，从2013年至2018年，年发文数量相对平稳。2019年发文量为10篇，占总文献集的34%。文献被引次数逐年增加，总被引次数为572次，其中2019年的被引次数为222次，占总被引次数的39%。Spohn等[1]在2013年首次以“soil zymography”为题发文在SoilBiology&Biochemistry上，目前该篇论文的被引次数为50次。单篇文献最高被引次数为85次，是Spohn等[14]于2013年发表在SoilBiology&Biochemistry上的另一篇论文。这些数据说明土壤原位酶谱技术经过几年的发展和不断完善，即将迎来快速发展的时期。

图2 土壤原位酶谱技术相关文献的发文数量和被引次数

2.2 论文来源国家/地区和研究机构

通过检索，土壤原位酶谱技术相关论文的来源国家/地区共14个。从表1可以看出，德国的发文或参与发文数量和总被引次数高居首位，分别为24篇和436次。因为总发文数量为29篇，而德国发文量或参与发文量占83%，说明德国是土壤原位酶谱技术研究的主要参与国家。参与土壤原位酶谱技术研究领域的机构超过了40个，其中德国哥廷根大学参与发文量最多，发文数量为18篇，其次是俄罗斯土壤科学理化与生物问题研究所和德国基尔大学。中国科学院、中国科学院大学、成都理工大学及中国环境科学院为主要国内参与发文机构。如图3所示，圆圈大小表示发文数量的多少，连线是表示不同研究机构间联系的密切程度。德国哥廷根大学和基尔大学为土壤原位酶谱技术研究的中心，基本所有的发文机构均与这两所大学有合作。其中哥廷根大学的农业土壤系及温带生态系统土壤系和基尔大学的土壤科学与植物营养系为主要研究实验室。

图3 土壤原位酶谱技术论文产出的主要研究机构之间的合作

表1 土壤原位酶谱技术研究发文的国家/地区

2.3 发文的国际刊物

由HistCite软件分析结果(表2)可见，共有10种期刊刊载了土壤原位酶谱技术相关论文，其中发文量最多的期刊是SoilBiology&Biochemistry，占发文总量的 59%。其次为PlantandSoil和BiologyandFertilityofSoils，分别占发文量的10%和7%。土壤原位酶谱技术相关论文在SoilBiology&Biochemistry，总被引次数为350次；其次为PlantandSoil，总被引次数为59次。但是土壤原位酶谱技术相关论文的篇均被引频次和五年影响因子最高的期刊为TrendsinPlantScience，篇均被引次数为48次，该期刊的五年影响因子为14.0。期刊SoilBiology&Biochemistry发表的土壤原位酶谱技术相关论文的篇均被引频次为20.6次。期刊的学科类别有5种，分别为土壤科学(soil science)、植物科学(plant sciences)、农艺学(agronomy)、环境科学(environmental science)和毒理学(toxicology)。

表2 土壤原位酶谱技术研究领域发文的期刊

2.4 主要研究学者

通过HistCite软件分析结果可见，参与土壤原位酶谱技术领域研究的学者目前共有79人。其中参与发文量大于2篇(包括2篇)的共有29人。如图4所示，圆圈大小表示发文数量，连线是研究学者之间的相互合作关系。其中，Razavi B S发文数量最多为18篇，其次为Kuzyakov Y和Blagodatskaya E，分别参与发文数量为16和10篇。多数研究者均与以上3位研究者有合作关系。土壤原位酶谱相关论文的总被引次数最多的研究学者是Kuzyakov Y，为385次，其次为Razavi B S和Spohn M，总被用次数分别为218和213次，Blagodatskaya E的总被用次数为163次。

图4 发文数量(≥2)的研究学者之间的合作关系

2.5 土壤原位酶谱技术的研究热点

论文中关键词可以简要表达文章的主要研究内容，所以一个关键词出现的频率越大，说明相关的主题为主要研究热点。在关键词共线网络中，与土壤原位酶谱技术(soil zymography)关系密切的有空间分布(spatial distribution)、根际(rhizosphere)、磷酸酶活性(phosphatase activity)、酶活性(enzyme activities)、热点(hotspots)、微生物群落结构(microbial community structure)、微生物量(microbial biomass)、机制(mechanisms)、碳(carbon)等(图5)。土壤原位酶谱技术不仅可以可视化多种酶活性的空间分布特征，还可以确定植物根际的区域大小，进而可以精确地从根际区域采集土壤进行土壤微生物量和微生物群落结构等的分析，为探索土壤-微生物-植物之间的相互作用机理提供了更好的途径。目前可运用土壤原位酶谱技术可视化的酶共有10种，其中磷酸酶作为酶活性相关的关键词出现的频次较高，说明了对土壤磷素研究是目前土壤科学的一个研究热点。

图5 土壤原位酶谱技术研究论文中重要关键词的共线网络

3 小结与展望

本文利用Web of Science数据库，对土壤原位酶谱领域的研究论文进行了文献计量学分析。结果表明，在全球范围内对土壤原位酶谱领域的研究越来越重视。土壤原位酶谱领域是土壤学科和植物学科的重要交叉领域，研究学者对土壤原位酶谱技术更广泛的应用和重视对土壤学和植物学的发展起到了积极的推动作用。德国、俄罗斯、中国和美国的等国家在该领域发文较多，其中德国哥廷根大学和基尔大学为该领域研究的中心。不同机构的研究学者合作紧密，以Kuzyakov Y和Razavi B S为高频次被引学者。土壤原位酶谱技术的主要发文期刊为SoilBiology&Biochemistry。土壤原位酶谱技术未来研究趋势主要集中于根际。根际是土壤与植物连接的最为活跃的区域，土壤原位酶谱技术可以结合微生物高通量测序技术以及同位素示踪技术，更好地促进对根际区域的微生物群落、根系分泌物代谢机理、土壤-植物互作(例如土传病害)、碳氮磷等元素的利用效率、植物光合碳分配问题、重金属对土壤根系和微生物的影响等方面的研究。但是，土壤原位酶谱技术在操作方式、应用环境、底物浓度选择及后期图像数值化处理等方面依然存在不足，有待进一步规范和优化。